咪唑啉2受体配体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学及基质金属蛋白酶-9的影响

童巧文 朱英标 郑荣远

咪唑啉2受体配体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠行为学及基质金属蛋白酶-9的影响

童巧文 朱英标 郑荣远

目的 观察咪唑啉2受体配体（2BFI）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的行为、病理和脑脊髓中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。 方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型，将小鼠随机分为5组：药物干预组（EAE+2BFI 5 mg·kg-1组、EAE+2BFI 10 mg·kg-1组、EAE+2BFI 20 mg·kg-1组）、阳性对照组（EAE+NS组）、正常对照组（完全福氏佐剂+NS组），观察比较各组行为学和病理组织学的变化，通过RT-PCR技术测定大脑和脊髓MMP-9 mRNA水平，并用免疫组化方法观测2BFI对大脑组织MMP-9阳性表达的影响。 结果 与EAE+NS组比，2BFI 10、20 mg·kg-1药物干预组的最高行为学评分和病理变化均有减轻；而且三种不同剂量2BFI干预组大脑和脊髓组织MMP-9mRNA水平和大脑组织中MMP-9阳性表达均较EAE+NS组明显降低。结论 2BFI对EAE有保护作用，可能与其调节抑制MMP-9，保护血脑屏障，减少炎症细胞通过血脑屏障有关。

咪唑啉2受体配体 实验性自身免疫性脑脊髓炎 基质金属蛋白酶-9

既往众多研究表明咪唑啉2受体（I2R）与抑郁症、帕金森病、亨廷顿病、阿片成瘾及阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生有关[1-2]。咪唑啉受体拮抗剂咪唑克生（idazoxan，Ida）能减轻大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的行为学及病理变化，能明显减少EAE大鼠中枢神经系统（CNS）内炎症因子的表达[3]。Ida主要与I2R结合,但同时也具有α2-受体拮抗作用和较弱的5-HT1A受体激动效应。较之Ida，2BFI是一种高选择性I2R配体，对I2R的结合具有高选择性（Ki=1.71nM），在兔脑中能够特异性结合高于90%的I2R结合位点。所以2BFI能够更好地论证I2R的生物学功能，目前被广泛用于I2R的相关研究[4-5]。本部分实验通过采用2BFI对EAE小鼠进行干预，并进一步观察2BFI对EAE小鼠中枢神经系统中金属蛋白酶表达的影响，以初步观察2BFI对EAE的作用及探讨相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂 C57BL/6小鼠40只，雌性，8～10周龄，体重18～20g，由北京军事动物研究所提供，MOG 35～55多肽（西安美联多肽技术公司），完全福氏佐剂（CFA）、百日咳毒素（PT，美国Sigma公司）；结核分支杆菌菌素（H37Ra，美国Difco公司）；2BFI（英国Tocris公司）。

1.2 EAE模型建立方法 用0.01mol/L的PBS将MOG 35～55稀释为200～250μg/ml，然后将稀释液与等量的CFA（结核杆菌的终浓度为3mg/ml）充分混合，通过三通管将乳剂抽打为油包水状态，即为诱导EAE的抗原乳剂。EAE组小鼠于背部两侧皮下注射抗原乳剂（内含MOG 35～55抗原250μg/只）。对照组不予抗原处理。免疫后即刻及48h给予全部小鼠（包括对照组）腹腔注射PT，每只动物500ng/0.2ml。

1.3 动物分组 按照分层随机法编入以下5组：（1）CFA+0.9%氯化钠溶液（NS）组（8只）：将CFA代替MOG免疫小鼠，并于即刻及48h腹腔注射PT，免疫当天开始给0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（2）EAE+NS组（8只）：按上述方法免疫小鼠建立模型，免疫当天开始给NS 0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（3）EAE+2BFI 5mg·kg-1组（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫当天开始给2BFI 5mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。（4）EAE+ 2BFI 10 mg·kg-1组（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫当天开始给2BFI 10mg·kg-1，腹腔注射,2次/d，共14d。（5）EAE+2BFI 20 mg·kg-1组（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫当天开始给2BFI 20mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。

1.4 体重检测及行为学评价 免疫当天起每天对小鼠称重，连续观察至小鼠发病高峰期，采用双盲法进行神经功能评分，并按Weaver15分评分标准进行评分[6]。

1.5 组织取材与病理学检查 发病小鼠于发病高峰期处死取材，CFA+NS组全部于20d处死。取出大脑和腰髓石蜡包埋后切片，厚度5μm，取大脑视交叉层面、腰髓层面进行HE染色并参照Okuda[7]的病理分度标准进行组织学评分。0：没有炎症变化；1：炎症细胞浸润仅限于血管周围和脊膜周围；2：脊髓内轻微的炎症细胞浸润（1～10个细胞/片子）；3：脊髓内中度的炎症细胞浸润（11～100个细胞/片子）；4：脊髓内严重的炎症细胞浸润（＞100个细胞/片子）。

1.6 免疫组化测定MMP-9表达 取脑组织固定、包埋、切片，裱于多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上。参考SP法说明书进行免疫组化染色，所有操作均严格遵循说明书。同时设阴性对照片，用PBS代替一抗，余步骤相同。棕黄色为阳性染色,无着色为阴性。

1.7 RT-PCR检测MMP-9mRNA 取50～100mg脊髓，根据Trizol reagent（Invitrogen）的说明一步法抽提总RNA。提取得到的RNA溶于20ml的1‰焦磷酸二乙酯（diethylpyrocar bonate，DEPC）水，取5ml稀释20倍。RNA提取后根据RT-PCR试剂盒（TaKaRa）的说明合成cDNA。PCR引物通过查找Pubmed基因库内相应基因的参考序列，应用primer primier 5.0自行设计，由上海生工合成。MMP-9参考序列号为NM0135 99，顺义链为5′-CTACTCTGAAGACTTGCCG-3′，反义链5′-CCATACAGTTTATC CTGGTC-3′，601 bp。β-肌动蛋白（β-actin）参考序列为NM 007393，顺义链为5′-AGGGAGACCAAAGCCTTCAT-3′，反义链为5′-CCCACTCCTAAG AGGATG-3′，214 bp；取顺义和反义引物各200ng和1或2ml的cDNA按照RT-PCR试剂盒说明组成20ml的PCR反应体系，94℃预扩增5min后，进入循环体系，MMP-9的扩增条件为，94℃30s→58℃30s→72℃1min，34个循环；β-actin的扩增条件为，94℃30s→55℃30s→72℃1min，32个循环，然后72℃延伸5min。取PCR产物5ml用1.5%的琼脂糖凝胶（EB 0.5mg·ml-1）电泳，用Gel Documentaion system（BiosensSC6200）凝胶成像系统和Gel-Pro 3.2分析结果，以目的基因与β-actin的灰度Volume之比作为反映目的基因mRNA水平的相对指标。

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计量资料采用表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；两组比较用t检验；率的比较用χ2检验。

2 结果

2.1 发病情况 小鼠于免疫后第13天左右开始发病，先出现精神萎靡,体重下降，尾部张力消失，尾巴拖地不能抬起，继而后肢无力、步态异常、瘫痪，一般于17d左右达到高峰期。与EAE+NS组相比，EAE+2BFI各干预组在发病率、潜伏期、高峰期均无统计学意义，但EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20mg·kg-1组神经症状评分较EAE+NS组减轻（均P＜0.01），3个EAE+2BFI干预组病理评分较EAE+NS组减轻，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01），具有保护EAE的作用；2BFI干预对EAE发病率有减低趋势（表1）。

2.2 病理学改变 HE染色：CFA+NS组大鼠的脑及脊髓的病理检查未发现炎性细胞浸润。EAE+NS组的脑、脊髓实质内小血管周围有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，典型者呈血管袖套样改变。脊髓处更为明显。3个2BFI干预组炎症浸润程度均比EAE+ NS组轻，其中以EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20 mg·kg-1组有统计学意义（P＜0.05或0.01）（表1）。

2.3 免疫组化结果 MMP-9在EAE小鼠脑内有大量表达，典型的MMP-9阳性细胞胞质出现浓染的棕黄色颗粒，阳性细胞主要表达在脊膜细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞的胞质内（图1～5）。EAE+2BFI 5、10、20 mg· kg-1组CNS中MMP-9表达明显减少，MMP-9在空白对照组小鼠大脑中表达不明显。

表1 各组动物发病情况、神经功能评分和病理评分的比较

图1 CFA对照组大脑，未见MMP-9阳性表达（免疫组化染色，×400）

图3 EAE+2BFI 5 mg· kg-1组大脑，可见MMP-9阳性细胞的表达,与EAE组相比其表达减少（免疫组化染色，×400）

2.4 RT-PCR结果 大脑和脊髓MMP-9 mRNA的表达，可见EAE+2BFI 5、10、20 mg·kg-1干预组较EAE+NS组明显减少（均P＜0.01），其中EAE+2BFI 10、20mg·kg-1与EAE+2BFI 5 mg·kg-1比较，差异也有统计学意义（均P＜0.01），说明前两组对MMP-9降低作用更为明显（表2、图6）。

表2 2BFI对EAE小鼠脑和脊髓MMP-9 m RNA表达的影响

图6 各组中枢系统MMP-9mRNA的表达电泳图

图 4 EAE+2BFI 10 mg· kg-1组大脑，可见MMP-9阳性细胞的表达,与EAE组相比其表达减少（免疫组化染色，×400）

图 5 EAE+2BFI 20 mg· kg-1组大脑，可见MMP-9阳性细胞的表达,与EAE组相比其表达减少（免疫组化染色，×400）

3 讨论

目前认为多发性硬化及其动物模型是以T细胞介导为主的以中枢神经系统单核细胞浸润、白质脱髓鞘和轴索损伤为特征的自身免疫反应性疾病。其中血脑屏障（BBB）的破坏导致炎症细胞侵入CNS的过程是EAE发病的重要环节。

MMP-9又称明胶酶B，其主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ型胶原、弹性蛋白等，参与了MS的局灶性血脑屏障损害、淋巴细胞募集、血管周围炎症浸润等病理损害。体外实验表明MMP-9通过降解血管内皮细胞中的基质蛋白而增加微血管通透性，介导炎症细胞穿透BBB[8]。Kieseier等[9]发现在EAE大鼠模型中MMP-9mRNA水平较正常组明显增高，MMP-9达峰值与疾病严重程度一致，明胶酶谱法亦证明MMP-9的蛋白水解活性增加。无论在EAE小鼠还是MS患者CFS中均发现MMP-9蛋白表达增加，并且与病情相关[10-11]。Dubois等[12]发现＜4周龄的MMP-9敲除小鼠相对于正常小鼠对EAE的易感性降低，平均临床评分明显减少，但是上述现象在成年鼠实验中并不明显。以上研究均提示MMP-9对EAE或MS的发病有着重要作用。本实验免疫组化显示EAE+ NS组小鼠脑组织内MMP-9阳性细胞的表达增多，而CFA+NS对照组未见MMP-9阳性表达，此结果与上述观点一致。

本实验应用2BFI来干预EAE，结果发现EAE+ 2BFI 10、20mg·kg-1干预组小鼠临床评分和病理学评分均明显低于EAE+NS组大鼠。根据我们实验的免疫组化染色和RT-PCR检测结果，3个不同剂量2BFI干预组小鼠脑脊髓MMP-9的表达明显低于EAE阳性对照组，其中以EAE+2BFI 10、20mg·kg-1两组更为明显。故EAE+2BFI组中对MMP-9的抑制在宏观水平、蛋白水平及转录水平均有体现。提示2BFI能够抑制EAE的发病，减轻发病小鼠的临床症状。这可能是由于2BFI的作用使得星形胶质细胞的增值活化作用，并减少其氧化应激反应，促进EAE恢复。在既往的研究已经报道咪唑啉配体能增加星形胶质细胞上GFAP标志蛋白的表达，并促进其活化增殖[13-14]。Pagenstecher等[15]发现在EAE中，激活的星形胶质细胞能产生多种TIMPs（金属蛋白酶组织抑制剂），导致MMP-9降低。因此2BFI可能同时参与调节EAE中MMPs和TIMPs的失衡。

综上所述，2BFI作为咪唑啉受体配体对EAE具有保护作用，减轻临床症状和病理组织学损伤程度，降低EAE小鼠MMP-9的表达。因此，可以将咪唑啉受体的应用作为一种治疗EAE或MS的新思路，进一步研究和探索其保护机制。

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Effect of 2BFI on behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

2BFIExperimental autoimmune encephalomyelitisrats(EAE)Matrix metalloproteinase-9(MMP-9)

2012-05-14）

（本文编辑：沈昱平）

国家自然科学基金资助项目（81070960）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2090923）

325000 温州市人民医院神经内科（童巧文）；丽水市人民医院神经内科（朱英标）；温州医学院附属第一医院神经内科（郑荣远）

郑荣远，E-mail:zhengry@yahoo.com.cn

【 Abstract】Objective To investigate the effect of 2BFI on the behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)mice,Methods C57B/L mice were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)to establish the mice model of EAE.The mice were randomly divided into 5 groups：EAE+2BFI groups(2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1),EAE+NS group and CFA+NS group.After immunization,the mice in EAE+2BFI groups were treated with intraperitoneal injection of 2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1,respectively;whereas the mice in EAE+NS and CFA+NS groups were treated with an intraperitoneal injection of 0.1ml normal saline.The immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-9 protein and RT-PCR was used to determine MMP-9 mRNA expression.Results In 2BFI 10 and 20 mg·kg-1groups,the maximum clinical scores and pathological change were both decreased.Compare with EAE+NS Group,the expression of MMP-9 protein and mRNA in the brain of EAE mice was decreased in three EAE+2BFI groups.Conclusion 2BFI can protect mice from EAE,which is associated with reduced MMP-9 expression in central nervous system.