脓毒症肺损伤治疗中辣椒素对TLR4-NF-κB通路的影响

徐子琴 陈新国 徐建国 卢中秋 徐丽艳 南超

脓毒症肺损伤治疗中辣椒素对TLR4-NF-κB通路的影响

徐子琴 陈新国 徐建国 卢中秋 徐丽艳 南超

目的 探讨辣椒素受体（TRPV1）激动剂辣椒素在脓毒症肺损伤治疗中对TOLL受体（TLR）4-核因子（NF）-κB通路的影响。方法选取ICR小鼠108只，按随机数字表法分为6组：正常对照组（CON组）、辣椒素对照组（CAP+CON组)、TRPV1拮抗剂Capsazepine对照组（CAPZ+CON组）、脓毒症组（LPS组）、辣椒素组（CAP组)、Capsazepine组（CAPZ组）。LPS组、CAP组、CAPZ组均腹腔注射脂多糖（LPS）10mg/kg以制备LPS肺损伤模型，对照组经腹腔注射等量0．9%氯化钠溶液。造模前0．5hCAP组、CAP+CON组小鼠预先腹腔注射辣椒素，而CAPZ组、CAPZ+CON组小鼠则注射Capsazepine。每组取注射后3、8、16h等各时点检测肺组织NF-κB mRNA、TLR4 mRNA的表达量和肺组织含水量变化。结果与CON组比较，LPS组、CAP组、CAPZ组肺组织含水量在8、16h均有所上升（P＜0．05）；LPS组、CAP组、CAPZ组NF-κB mRNA、TLR4 mRNA在3、8、16h均表达增强 （均P＜0．05）；与LPS组比较，CAP组肺组织含水量在8、16h均下降，NF-κB mRNA在8、16h均表达减弱（均P＜0．05）。结论LPS肺损伤时TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达增强，肺组织含水量增加，辣椒素可能通过抑制NF-κB mRNA表达来减轻肺损伤，但对TLR4表达无影响。

脓毒症 脂多糖 辣椒素 TOLL样受体 核因子κB 肺损伤

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the protective effects of capsaicine on lung injury in septic mice and its mechanism．MethodsOne hundred and eight ICR male mice were randomly divided into six groups with 18 animals in each group．Septic model was induced by injection of lipopolysaccharide(LPS,10mg/kg)in LPS,CAP and CAPZ groups;0．5h before LPS administration normal saline,capsaicine and capsazepine(TRPV1 antagonist)were injected intraperitoneally respectively．For 3 control groups(CON,CAP+CON and CAPZ+CON groups),normal saline,capsaicine and capsazepine were injected i．p,respectively．The expressions of NF-κB mRNA and TLR4mRNA were detected by RT-PCR at 3,8 and 16h after injection and the histopathological changes and lung water contents were also observed．ResultsCompared to CON group,the lung tissue water content was increased in LPS,CAP and CAPZ groups at 8 and 16h after injection;the expressions of NF-κBmRNA and TLR4mRNA were increased in LPS,CAP and CAPZ groups at 3,8h and 16h(P＜0．05)．Compared to LPS group,the lung tissue water content and the expression of NF-κBmRNA were decreased in CAP group at 8h and 16h after injection(P＜0．05)．ConclusionCapsaicine attenuates lung injury of septic mice,which is associated with up-regulated expression of NF-κBmRNA,but not with TLR4mRNA．

脓毒症是严重创（烧）伤、感染和外科大手术应激后常见的并发症，是导致临床危重病患者死亡的重要原因之一。在脓毒症发病过程中，肺脏的损伤发生较早，可发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），最终导致多脏器功能衰竭和死亡。LPS/TOLL受体（TLR）4-核因子（NF）-κB介导的失控性炎症反应是脓毒症急性肺损伤发生的主要原因[1]，而脓毒症中TLR4在含辣椒素受体（TRPV1）的三叉神经元上有表达，并且TRPV1激动剂辣椒素能改善脓毒症大鼠的低血压，降低其病死率[2-5]。笔者通过构建脓毒症肺损伤模型，采用辣椒素激活或拮抗剂阻断TRRV1，观测TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达的变化，以及肺组织的病理改变、肺组织含水量的变化等，进一步探讨TRPV1激动剂辣椒素在脓毒症肺损伤治疗中对TLR4-NF-κB通路的影响机制。

1 材料和方法

1.1 材料 选取ICR雄性小鼠108只（温州医科大学实验动物中心提供），体重18～22g，按随机数字表法分成6组：正常对照组（CON组）、辣椒素对照组（CAP+ CON组)、TRPV1拮抗剂Capsazepine对照组（CAPZ+ CON组）、脓毒症组（LPS组）、辣椒素组（CAP组)、Capsazepine组（CAPZ组），每组18只。

1.2 试剂和仪器 脂多糖（LPS）、辣椒素、Capsazepine均购自美国Sigma公司。Trizol reagment购自美国Invitrogen公司，逆转录-PCR（RT-PCR）试剂盒购自日本Thermo Scientific公司；Tap PCR master mix试剂盒购自北京天根生化科技公司，PCR引物均由上海基康生物工程公司设计合成，详见表1。梯度PCR仪购自美国BioRAD公司，台式超速冷冻离心机购自美国Beckman公司，凝胶成像分析系统购自美国BioRAD公司，水平电泳仪购自北京六一电泳厂。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 模型建立 LPS组、CAP组、CAPZ组采用腹腔注射LPS 10mg/kg复制脓毒症肺损伤模型；CON组、CAP+ CON组、CAPZ+CON组经腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。CAP+CON组、CAP组在建模前0.5h腹腔注射辣椒素1mg/kg；CAPZ+CON组、CAPZ组在建模前0.5h腹腔注射Capsazepine15mg/kg。

1.3.2 肺组织处理 每组分别在制模后3、8、16 h各取6只小鼠，腹腔注射4%水合氯醛6～10ml/kg麻醉，开胸取左肺吸干表面液体，称湿重，然后放入80℃烤箱烘至恒重，称干重；计算肺组织含水量：肺含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。处死小鼠，即刻取右肺下叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，每例切片3张，HE染色，光镜下观察肺组织病理变化；其余肺组织液氮保存待用。

1.3.3 RT-PCR检测小鼠肺组织 NF-κB mRNA和TLR4 mRNA Trizol试剂提取小鼠肺组织细胞总RNA，检测浓度及纯度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，按PCR扩增试剂盒说明书进行进行扩增，反应条件为94℃预变性3min→变性（94℃，30s）→退火30s（NF-κB：57.3℃，TLR4：63℃）→延伸（72℃，1min）→热循环35次→72℃，5min→4℃，1h。采用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像分析系统扫描图像，并用Quantity one进行灰度值分析，得出NF-κB mRNA和TLR4 mRNA基因表达相对量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 各组肺组织含水量的变化 见表2。

表2 各组肺组织含水量的变化（%）

由表2可见，与CON组比较，CAP+CON组、CAPZ+ CON组肺组织含水量在3、8、16h的差异均无统计学意义（均P＞0.05)；LPS组、CAP组、CAPZ组肺组织含水量在8、16h各点均有上升，与CON组的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与LPS组比较，CAP组肺组织含水量在8、16h均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），CAPZ组在3、8、16h各点与LPS组的差异均无统计学意义（均P＞0.05)。

2.2 各组光镜观察结果 CON组、CAP+CON组、CAPZ+CON组3组肺组织结构完整，肺泡间隔无水肿、炎症，肺泡腔清晰；LPS组8、16h时可见肺泡大小不等，部分肺泡壁断裂呈气肿状，部分肺泡萎陷，肺泡壁增宽，肺泡毛细血管扩张，肺间质见多行核炎症细胞浸润；CAP组较LPS组渗出明显减轻；CAPZ组与LPS组相比无明显加重。

2.3 各组肺组织NF-κB mRNA表达的比较 见表3。

由表3可见，与CON组比较，CAP+CON组、CAPZ+ CON组肺组织NF-κB mRNA在3、8、16h各点的差异均无统计学意义（均P＞0.05)，LPS组、CAP组、CAPZ组NF-κB mRNA在3、8、16h各点均表达增强，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与LPS组比较，CAP组在8、16h表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），而CAPZ组在3、8、16h各点的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表3 各组肺组织NF-κB mRNA表达的比较

2.4 各组肺组织TLR4 mRNA的表达变化 见表4。

表4 各组肺组织TLR4 mRNA的表达

由表4可见，与CON组比较，CAP+CON组、CAPZ+CON组肺组织TLR4 mRNA在3、8、16h各点的差异均无统计学意义（均P＞0.05），LPS组、CAP组、CAPZ组肺组织TLR4 mRNA在3、8、16h均表达增强，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与LPS组比较，CAP组、CAPZ组在3、8、16h各点的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

在脓毒症致病过程中，肺部损伤发生较早也最为突出，是导致脓毒症死亡的重要原因。目前认为脓毒症肺损伤发生与炎症介质的过度释放密切相关，而TLR4-NF-κB信号通路是导致肺部炎症性损伤的核心环节。LPS与TLR 4和黏附分子（CD）14结合后可激活NF-κB，介导包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6等众多炎症因子的基因表达，这些过度释放的炎症因子反过来又可以进一步激活NF-κB，从而形成正反馈的级联放大效应，产生过度的炎症反应，引起肺脏组织和细胞损害的发生[5]。

TRPV1是一种配体门控的非选择性阳离子通道，主要定位于分泌P物质和降钙素基因相关肽（CGRP）的感觉神经纤维C和Aδ[6]。辣椒素是TRPV1常见的激动剂，是一种香草酰胺衍生物，化学结构为8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺（C18H27NO3），呈单斜长方形片状无色结晶，辣椒素在体外对细菌有很好的抑菌活性，不仅对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果，对大肠杆菌、酵母菌、霉菌等也有一定的抑菌效果[7]，更有动物实验发现辣椒素不仅能改善内皮细胞功能，减轻LPS细胞凋亡，还能改善脓毒症大鼠的低血压，降低其病死率，减轻肺损伤的氧化应激反应。脓毒症患者和细菌性脑膜炎患者动脉血中CGRP升高[8]，也有研究发现TLR4与TRPV1在感觉神经上共定位的现象[4，9]，因此TRPV1与LPS/TLR4-NF-κB信号通路相关的病理生理学过程可能存在某种联系。

本研究中CON组、CAP+CON组、CAPZ+CON组3组的TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、肺病理变化、肺组织含水量等方面的差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示TRPV1激动作用可能仅在脓毒症肺损伤时对肺组织过度表达的TLR4-NF-κB通路有影响，从而遏制过度炎症反应的产生，而在非脓毒症状态时并无此作用。与CON组比较，LPS组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达增强，这与其他学者的研究相符合[5]；CAP组和CAPZ组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA也较CON组增强，提示辣椒素只能减轻肺损伤，而影响脓毒症引起的肺组织TLR4-NF-κB通路的因素可能为多方面，激活TRPV1受体只是其中之一。与LPS组比较，激动TRPV1受体的CAP组NF-κB mRNA表达均较LPS组减弱，提示辣椒素有保护效应，而肺组织光镜的病理改变也较LPS组减轻，肺组织含水量减少，也说明其对脓毒症引起的肺损伤有一定保护作用；但TLR4 mRNA表达无明显变化，拮抗TRPV1的CAPZ组也并未看到TLR4 mRNA表达明显增强，结合脓毒症可通过TLR4表达的增加来激活三叉神经元上的TRPV1[4]，提示TRPV1激动对TLR4-NF-κB通路的影响效力仅在NF-κB，TRPV1可能在TLR4的下游，对TLR4无逆向干预之力。因此，脓毒症肺损伤时TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达增强，TRPV1激动可通过抑制NF-κB mRNA表达来减轻肺损伤，但对TLR4 mRNA表达无影响。

综上所述，本实验通过辣椒素激活或拮抗剂阻断TRPV1，从正反两方面论证辣椒素在脓毒症肺损伤治疗中的潜在价值；同时，通过检测TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表达和活性改变及肺组织含水量的变化，探讨TRPV1受体在脓毒症肺损伤治疗中的作用机制，不仅深化了TRPV1与炎症反应关系的认识，同时也为脓毒症治疗提供了新的靶标和理论依据。

[1] 陈晓彤,王寿平,邹子俊,等．Toll样受体4单克隆抗体预处理对脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的影响[J]．中华急诊医学杂志,2011,20(10): 1052-1055．

[2]Wang Y,Novotny M,Quaiserová-Mocko V,et al．TRPV1-mediated protection against endotoxin induced hypotension and mortality in rats[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2008, 294(5):1517-1523．

[3]Chularojmontri L,Suwatronnakorn M,Wattanapitayakul S K．Influence of capsicum extract and capsaicin on endothelial health[J]．J Med Assoc Thai,2010,93:S92-101．

[4]Abdel-Salam O M,Abdel-Rahman R F,Sleem A A,et al．Modulation of lipopolysaccharide-induced oxidative stress by capsaicin[J]．Inflammopharmacology,2012,20(4):207-217．

[5] Diogenes A,Ferraz C C,Akopian A N,et al．LPS sensitizes TRPV1 via activation of TLR4 in trigeminal sensory neurons[J]．J Dent Res, 2011,90(6):759-764．

[6] Khadija Alawi,Julie Keeble．The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation[J]．Pharmacol Ther,2010,125(2):181-195．

[7]张继红,陶能国,李俊丽,等．辣椒素的提取及抑菌活性研究[J]．广西植物,2010,30(1):137-140．

[8] Berg R M,Strauss G I,Tofteng F,et al．Circulating levels of vasoactive peptides in patients with acute bacterial meningitis[J]．Intensive Care Med,2009,35(9):1604-1608．

[9] Zakir H M,Mostafeezur R M,Suzuki A,et al．Expression of TRPV1 channels after nerve injury provides an essential delivery tool for neuropathic pain attenuation[J]．PLoS One,2012,7(9):e 44023．

Protective effects of capsaicine on lung injury in septic mice and its mechanism

Sepsis Lipopolysaccharide Capsaicine TOLL receptorNuclear factor of kappa B Lung injury

2013-03-28）

（本文编辑：严玮雯）

温州市科技局课题（Y20100302）

325000 温州市人民医院重症医学科（徐子琴、徐建国），急诊科（陈新国）；温州医科大学附属第一医院急诊科（卢中秋、徐丽艳、南超）

徐子琴，E-mail:xuziqin1980206@sina.com