NGF对LASIK及Epi-LASIK术后角膜中TrkA受体表达作用的研究

余洁 赵海岚 吴苗琴

NGF对LASIK及Epi-LASIK术后角膜中TrkA受体表达作用的研究

余洁 赵海岚 吴苗琴

目的 观察兔眼准分子激光原位角膜磨镶术（LASIK）及准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术（Epi-LASIK）术后局部点用神经生长因子（NGF）后角膜组织中酪氨酸激酶受体A（TrkA）的表达情况，探索术后干眼症的防治方法。方法将30只新西兰纯种兔，抽取15只30眼接受LASIK手术，余接受Epi-LASIK手术。术后每只兔子一眼滴NGF滴眼液，为实验眼，对侧眼滴0．9%氯化钠溶液，为对照眼。1周后进行免疫组化分析，检测角膜上皮细胞层以及角膜基质层中TrkA的表达情况。结果观察TrKA的表达，接受LASIK或Epi-LASIK手术后，滴用NGF滴眼液的眼均较对照眼强。LASIK组以及Epi-LASIK组滴用NGF眼两者比较TrkA的表达无统计学差异。结论滴用NGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK术后TrkA受体表达均较高，可能有助于防治近视激光术后干眼症。

神经生长因子 酪氨酸激酶受体A 准分子激光原位角膜磨镶术 准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术 干眼症

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of nerve growth factor(NGF)on the expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK．MethodsSixty eyes of 30 New Zealand white rabbits underwent LASIK or Epi-LASIK procedures with 30 eyes in each group．One eye,randomly selected in each rabbit was treated with topical NGF for 1 week,while the contralateral eye was treated with normal saline as control．The expression of NGF receptor(TrkA)on cornea was detected by histoimmunochemistry．ResultsThe expression of TrkA on the cornea treated with the topical NGF after LASIK or Epi-LASIK was stronger than that of control group．There was no difference in expression of TrkA between LASIK and Epi-LASIK groups． Conclusion Topical treatment of NGF can up-regulate the expression of TrkA in the cornea of rabbits after LASIK or Epi-LASIK．

随着近视眼角膜屈光手术的广泛开展，手术后干眼症问题越来越受到重视。目前临床上对干眼症的治疗主要局限在应用人工泪液来缓解患者的干眼症状。由于人工泪液与正常泪液的成分相差甚远，人工泪液的使用一般只能起到缓解眼干症状的作用，而无明显的治疗效果。由于在近视激光术后所产生的干眼症，很大程度上与手术中切断了角膜的感觉神经有关[1-4]，因此如果能尽快修复神经的损伤，改善角膜上皮的营养，可以很大程度上防止干眼症的发生或缩短患者术后使用人工泪液的时间[5-6]。我们通过观察兔眼准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis，LASIK）及准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术（epipolis laser in situ keratomileusis，Epi-LASIK）术后局部点用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）后角膜组织中酪氨酸激酶受体A（TrkA）表达的改变，旨在了解外源性NGF对LASIK及Epi-LASIK术后干眼症可能的治疗作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 LASIK动物模型眼的制备 取眼部检查正常的健康新西兰大耳白兔30只（由浙江医学科学院实验动物中心提供，体重2～3 kg，雌雄兼备，普通级）。抽取15只30眼进行LASIK手术为LASIK组，另15只30眼进行Epi-LASIK手术为Epi-LASIK组。手术过程：用1%戊巴比妥钠针注射麻醉（30mg/kg体重），麻醉起效后，用不透水塑料袋包裹动物，暴露头部，剪掉眼睑周围较长睫毛，滴0.5%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉2次。用无齿镊和纹式钳轻轻上提眼球至脱臼状态，术中用纹式钳在眼球后稍加固定（避免钳夹视神经），+2号负压环（苏州康明公司产品）固定环吸附眼球，Moria-M2角膜刀制作130μm厚角膜瓣（Epi-LASIK组制作110μm厚角膜瓣），掀开角膜瓣做激光切削（AllegrettoWave鹰视准分子激光机，切削直径6 mm，切削量20μm），BSS液冲洗，LASIK组，角膜瓣复位缝线固定，Epi-LASIK组角膜瓣去瓣。

1.2 神经生长因子滴眼液的配置与使用及分组 苏肽生针剂（注射用鼠神经生长因子，由舒泰神药业有限公司惠赠），生物活性≥15 000Au（30μg）/支，为透明澄清水溶液，磷酸盐缓冲液调整pH值至7.3～7.5，过滤法除菌，分装放入4℃冰箱中备用。自LASIK及Epi-LASIK术后第1天起，所有手术眼术后均点妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，抗炎及预防性抗感染治疗，另外每只兔子右眼术后点用0.9%氯化钠溶液配置的100μg/ml的NGF，4次/d，每次50μl，连续滴1周，对侧眼滴用0.9%氯化钠溶液，4次/d，每次50μl，连续滴1周。滴用NGF的兔眼为实验眼，滴用0.9%氯化钠溶液的兔眼为对照眼。

1.3 标本采集 在动物模型建立后及滴眼液使用过程中常规每日进行裂隙灯检查。1周后，兔子均被静脉注射空气猝死，并立即在无菌条件下摘除眼球，剪除球结膜、筋膜、眼外肌、脂肪等结缔组织，剪除视神经。

1.4 免疫组化检测 将眼球组织进行脱水及石蜡包埋，进行免疫组化分析，检测角膜上皮细胞层以及角膜基质层中NGF高亲和力受体（TrkA）的表达情况。常规石蜡切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，高压修复抗原3min、3%H2O2孵育10min阻断内源性过氧化物酶、10%正常羊血清室温下封闭15min、滴加TrkA抗体（R&D Systems），4℃过夜，滴加生物素化二抗室温孵育20min，PBS洗5min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育20min，PBS洗5min×3次，DAB显色、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。一抗工作浓度为1∶10，同时，以PBS代替一抗作为阴性对照。

每例角膜组织选一张切片，每张切片随机选取角膜中央断面区域角膜上皮细胞及其周围约2cm×2cm大小（放大400倍）范围，用免疫组织化学图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）检测其平均吸光度值作为该区域的TrKA的相对含量。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，测得实验数据以表示，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 术后滴用眼水1周免疫组化角膜组织TrkA表达 显微镜下观察15只接受LASIK手术的新西兰兔子30只眼球的角膜切片组织，均可发现角膜上皮细胞的胞质显示为棕黄色，但显色强弱不一。实验组的角膜上皮细胞胞质显色均强于自身对照眼。显微镜下观察15只接受EPI-LASIK手术的新西兰兔子30只眼球的角膜切片组织，同样可发现角膜上皮细胞的胞质显示为棕黄色，但显色强弱不一。实验组的角膜上皮细胞胞质显色均强于自身对照眼（图1）。

图1 免疫组化染色检测各组新西兰纯种兔术后角膜上皮细胞TrkA的表达（A：LASIK实验眼；B：LASIK对照眼；C：Epi-LASIK实验眼；D：Epi-LASIK对照眼；×400）

2.2角膜组织中TrkA免疫组化法检测平均吸光度值比较 见表1。

表1 两组实验眼和对照眼TrKA平均吸光度值比较

由表1可见，LASIK组术后实验眼平均吸光度值与其对照眼比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。Epi-LASIK组术后实验眼平均吸光度值与其对照眼比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。LASIK组实验眼以及Epi-LASIK组实验眼比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

准分子激光屈光手术近年来由于其有效性和安全性已被广泛应用，但其并发症也引起了广泛的重视。干眼症是所有准分子激光手术后最常见的并发症，也是造成术后患者不满的常见原因。LASIK手术切断了三叉神经支配角膜的部分主干和分支，导致角膜的营养和触觉的异常。Epi-LASIK虽然不损伤角膜神经的主干，但制作角膜上皮瓣后切断了神经末梢，随后的激光切削进一步损伤基质层的神经纤维，仍可导致术后干眼症。

NGF作为人类发现的第一个生长因子，目前对其结构功能以及作用机制有了较为清楚的了解，NGF具有保护效应神经元和促进神经纤维生长的作用。一般认为神经损伤后施万细胞合成的NGF先与其膜上的低亲和力受体（主要是p75）结合，当再生轴突长入损伤远侧段或靶组织与施万细胞接触时，NGF从低亲合力受体上脱落,转而与再生轴突上的高亲和力受体（主要是p140，TrkA）结合，NGF便由施万细胞转移到轴突，经逆行运输至效应神经元胞体后，与受体特异性结合，通过控制Na+-K+泵活动等复杂机制，保护轴突受损的神经元存活，并促进蛋白质及微丝微管生物合成以利轴突再生。

目前对NGF在眼表组织中的表达情况已进行了比较深入的研究。有研究表明在人类的角膜组织上皮细胞以及角膜基质层中都可以检测到NGF和相关受体TrkA的表达[7]，而国外已有一些研究表明，在PRK以及LASIK手术后短期内泪液中的NGF浓度有比较明显的上升[8]，说明在近视激光术后角膜伤口的愈合过程中NGF起着一定的作用，并且发现对兔眼进行LASIK术后使用NGF，可以提高角膜的敏感性[9]。对于一些实验性的角膜上皮细胞缺损和角膜溃疡，NGF有促进伤口修复的作用[10-11]，NGF能够改善对于摘除动物的第三眼睑后造成的干眼症[12]等。所有这些信息表明近视激光术后外源性NGF的使用，可能会起到阻止干眼症发生的作用。

由于检测角膜上皮细胞层TrkA的表达情况，可以间接得知神经生长的状况。因此本实验通过观察比较LASIK或Epi-LASIK术后滴用NGF和0.9%氯化钠溶液的兔眼角膜上皮细胞层TrkA的表达情况，从而间接推断角膜神经的生长情况。实验证明：滴用浓度为100μg/mlNGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK术后角膜中TrkA受体表达水平明显较滴用0.9%氯化钠溶液的兔眼高，间接证明滴用外源性NGF，促进神经再生，角膜的营养提供得到保障，推测干眼症状有可能得到较快缓解，因此推测外源性NGF对LASIK及Epi-LASIK术后发生的干眼症可能起到一定的治疗作用。但LASIK术后以及Epi-LASIK术后皆滴用外源性NGF，两者TrkA的表达水平无统计学差异，说明两种不同的手术方式术后滴用外源性NGF，对TrkA表达水平的影响相似。

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Effect of nerve growth factor on expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK

NGF TrkA LASIK Epi-LASIK Xeroma

2012-10-19）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省医药卫生科技计划项目（2006A07）

310014 杭州，浙江省人民医院眼科中心

吴苗琴，E-mail：77janny@163.com