地黄饮子加减方对MCAO 模型大鼠血清HPA轴及其脑组织细胞凋亡表达的干预效应研究

唐璐 孙塑伦 高颖 朱陵群

地黄饮子原方出自刘完素《宣明论方》:“治喑痱，肾虚弱厥逆，语声不出，足软不用”，作为滋肾阴、补肾阳、化痰开窍的代表方剂，它被广泛运用于脑血管病、痴呆、神经系统变性病等的临床治疗。本实验通过观察地黄饮子加减方对大脑中动脉线栓(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠血清HPA 轴激素水平及其脑细胞凋亡表达的干预效应，探讨了缺血性中风急性期应用温阳补肾法对促进神经功能恢复，改善预后转归的作用机理。

1 材料与方法

1．1 动物及分组

成年SD 雄性大鼠30 只(北京维通利华实验动物技术有限公司SPF/VAF 级，合格证号:SCXK(京)2006－0009)。体重(280±10)g。动物称重编号，用随机数字表法［1］分为正常组、模型组、地黄饮子组，每组10 只。

1．2 MCAO 模型制备

模型组与地黄饮子组大鼠以大脑中动脉线栓法造模。以10%水合氯醛(0．35 mg·kg－1)将大鼠麻醉后仰卧固定，常规备皮，沿颈部正中线切开皮肤1．5 cm 左右，钝性分离颈部肌群，以开睑器充分暴露手术野，分离左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)及 颈 外 动 脉(external carotid artery，ECA)，结扎ECA 及CCA 近心端，CCA 远心端穿线备用。动脉夹夹闭ECA 分叉处。于CCA 剪开一个小口，插入头端直径为0．28 mm 的栓线。轻轻结扎固定栓线于CCA 内，开放动脉夹，将栓线插入颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，使其头端到达大脑中动脉起始处。扎紧固定线，缝合皮肤。术中用100 W 灯泡照射，严格控制室温。缝合伤口，清理血迹，将术后大鼠置于电热毯保持体温，直至苏醒。

1．3 药物制备及灌胃方法

地黄饮子加减方配伍及剂量:熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地12 g、石斛10 g、肉苁蓉12 g、五味子6 g、麦冬15 g。按人与动物体型系数折算，等效比例为7，总生药量316 g。将所有药物用10 倍量和8 倍量的水煎煮2 次，每次1 小时，合并水煎液，用旋转蒸发仪浓缩，制成含生药1．0 g·ml－1的药液备用，pH 值7．0。每日称重，按1 ml/100 g 的量连续灌胃7 天，其中地黄饮子组灌胃中药药液，模型组和正常组灌胃等量的生理盐水，于最后一次灌胃后1 小时取材。至取材时模型组大鼠死亡2 只，原因为术后腹腔感染、灌胃失误，剩余8 只;地黄饮子组大鼠死亡1 只，原因为灌胃失误，剩余9 只。

1．4 主要试剂

促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放射免疫试剂盒;促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫试剂盒;皮质醇(cortisol，COR)放射免疫试剂盒:由解放军总医院科技开发中心放免所提供。细胞凋亡原位检测试剂盒(TUNEL):美国罗氏公司进口分装。DAB 显色试剂盒:北京中杉金桥生物有限公司。

1．5 指标检测

1．5．1 血清下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamopituitary-adrenal axis，HPA)轴 大鼠麻醉后经腹主动脉取血4 ml，注入含30 μl EDTA、40 μl 抑肽酶的试管中静置，4 ℃3000 转/分离心15 分钟，取上清存－80 ℃冰箱备用。通过上海核所日环光电仪器有限公司Sn-695B 型免疫计数器测定放射强度，记录数值结果。

1．5．2 细胞凋亡表达(TUNEL 免疫组化法)TUNEL 免疫组化法检测细胞凋亡表达，阳性细胞为细胞核着棕黄色，阴性为细胞核着蓝色。通过安装在OlympusBX60 显微镜上的SPO-Ⅱ数码成相软件系统以及Metamorph 图像分析软件对TUNEL 免疫组化染色结果进行拍照分析。以统一的灰度值阈值作为度量标准界定阳性染色部位，采用阳性面积作为测量指标，每只大鼠选5 张切片，在20×10，40×10 的倍数下，于脑梗死中心区，梗死周边区，对侧正常区随机选取5 个视野进行拍照、测量，测定阳性信号平均光密度值，读取数据进行统计分析。

1．6 统计学处理

2 结果

2．1 地黄饮子加减方对MCAO 模型大鼠血清HPA轴的干预作用

正常组、地黄饮子组、模型组的ACTH、CRH、COR 各组数据经K-S 检验提示均符合正态分布，各组数据经ANOVA 方差分析提示总体有差异，以LSD法进行多组间比较，结果如表1 所示，在脑缺血发生后7 天，模型组的ACTH、CRH 含量均明显低于正常组，COR 含量明显高于正常组，差异有显著统计学意义;地黄饮子组的COR 明显低于正常组、模型组，差异有显著统计学意义;地黄饮子组ACTH、CRH 含量均明显高于模型组，差异有显著统计学意义;ACTH、CRH 含量略低于正常组，差异无统计学意义。

表1 各组大鼠灌胃7 天后血浆HPA 轴含量变化

2．2 地黄饮子对MCAO 大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应

如图1 ～3 所示，模型组、地黄饮子组梗死侧大脑皮层区均可见凋亡阳性细胞表达，胞核呈棕褐色，胞体缩小，染色不均，多集中于核膜下，可见核固缩和核碎裂。与模型组比较，经地黄饮子加减方灌胃的大鼠脑组织细胞凋亡表达明显减少。

图1 正常组大鼠脑组织细胞凋亡表达(TUNEL 染色，×400)

图2 模型组大鼠脑组织细胞凋亡表达

图3 地黄饮子组大鼠脑组织细胞凋亡表达(TUNEL 染色，×400)

正常组、地黄饮子组、模型组的脑组织细胞凋亡表达数据经K-S 检验提示均符合正态分布，各组数据经ANOVA 方差分析提示总体有差异，以LSD法进行多组间比较，结果如表2 所示，正常组为阴性，模型组、地黄饮子组脑组织与正常组相比均可见细胞凋亡表达，差异有显著统计学意义(P ＜0.01);模型组脑组织细胞凋亡表达较地黄饮子组明显，差异有显著统计学意义(P ＜0．01)。

表2 地黄饮子对MCAO 模型大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应()

表2 地黄饮子对MCAO 模型大鼠缺血后脑组织细胞凋亡表达的干预效应()

注:与正常组比较aP ＜0．05;与正常组比较bP ＜0．01;与模型组比较cP ＜0．05;与模型组比较dP ＜0．01;

分组 n 脑组织细胞凋亡表达95%CI正常组 10 0．00±0．00 (0．00，0．00)模型组 8 0．35±0．03ab (0．33，0．38)地黄饮子组 9 0．24±0．04abcd (0．22，0．27)

2．3 MCAO 大鼠缺血后血清HPA 轴与脑组织细胞凋亡表达的相关性分析

地黄饮子组、模型组的脑组织细胞凋亡表达各组数据经K-S 检验提示均符合正态分布，以双变量相关分析MCAO 大鼠血清HPA 轴含量与脑组织细胞凋亡表达的相关性，如表3 所示，模型组血清ACTH 含量与脑组织细胞凋亡表达存在显著负相关关系，但CRH、COR 则与凋亡表达无明显相关性，地黄饮子组血清ACTH、CRH、COR 含量与脑组织细胞凋亡表达均无明显相关性。

3 讨论

根据本实验结果，地黄饮子能够改善脑缺血大鼠HPA 轴的紊乱状态，通过提高CRH 含量抑制了大鼠体内COR 的释放。这一结果支持了钟历勇、沈自尹等［2］提出的补肾药可通过上调下丘脑CRF mRNA 表达来保护HPA 轴免受外源性皮质醇的抑制，补肾药对肾阳虚证的主要调节点定位于下丘脑的观点。

表3 模型组、地黄饮子组大鼠脑组织细胞凋亡表达与HPA 轴含量的相关性分析

模型组、中药组的梗死侧大脑皮层区域均可见有凋亡阳性细胞的表达，经地黄饮子加减方灌胃的中药组大鼠脑组织细胞凋亡表达明显减少。说明地黄饮子可明显抑制脑组织细胞凋亡的表达。王利军［3］曾通过实验证实，地黄饮子可能通过调节神经生长因子BDNF 及凋亡相关基因Bcl-2 和BAX 的表达来发挥抑制细胞凋亡、对抗脑缺血的作用。另有实验证实，加减地黄饮子可显著提高缺血脑组织内相关酶的活性，通过抗自由基损伤来实现对凋亡表达的抑制。脑组织缺血缺氧后的损伤机制较为复杂，抗损伤的途径也并不唯一，需进一步研究。

模型组ACTH 含量与脑组织细胞凋亡表达存在显著的负相关关系，CRH、COR 与凋亡表达无明显相关性，说明模型组血清ACTH 含量低于中药组，细胞凋亡表达较之更为明显，而其余指标之间无明显相关性的原因可能与样本量偏少有一定的关系。提示地黄饮子加减方抑制细胞凋亡，发挥脑保护作用的功效可能是通过改善HPA 轴的紊乱状态这一机制来实现的。

现代医学研究认为，肾阳虚证与神经内分泌免疫系统(NEIS)有关，肾阳虚证在下丘脑—垂体—靶腺(肾上腺皮质、甲状腺、性腺和胸腺)轴不同环节、不同程度的功能紊乱，且主要发病环节在下丘脑(或更高级)的调节功能紊乱［4］。HPA 轴在机体接受应激刺激后被激活，参与调控机体对应激的急性反应，介导一系列的代谢和心血管的代偿机制以克服应激原对机体的威胁或对内环境的扰乱作用，具有一定的积极意义。但过于剧烈的应激反应同时会促进和加剧炎症的发生，对免疫机制也有显著的抑制效应，通过NEIS 对机体产生应激损伤。本实验结果说明在脑缺血发生后早期使用中药地黄饮子加减方，能够稳定下丘脑—垂体—肾上腺系统的功能状态，使应激刺激和炎症反应的发生不至于过度剧烈，通过补肾的方法达到护脑的目的，在脑缺血急性期发挥了扶正的作用，对改善整体状态，缩短急性期病程，改善预后，都具有重要的临床参考价值。

中风病的病位在脑，脑与肾密切相关。肾虚既是其发病基础，又是病情发展过程中影响预后和病情轻重的关键因素。鉴于肾与脑的密切关系及肾虚在中风病因病机中的重要作用，在治疗时对急性期患者早期通过补肾的方法扶助正气，对帮助患者脑功能的恢复，减轻脑功能损害具有重要的意义。

［1］ 苗明三．实验动物和动物实验技术［M］．北京:中国中医药出版社，1997:142．

［2］ Tsigos C，Chrousos GP．Physiology of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis in health and dysregulation in psychiatric and autoimmune disorders［J］．Endocrinol Metab Clin North Am，1994，23(3):451-466．

［3］ 王利军．地黄饮子对大鼠脑缺血后脑内相关因子的影响［D］．北京:北京中医药大学，2003．

［4］ 蔡定芳，沈自尹，陈晓红，等．乌头碱对大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素含量的影响［J］．中西医结合杂志，1996，16(9):544．