我国梨腐烂病病原菌的初步鉴定及序列分析

周玉霞　程栎菁　张美鑫　翟立峰　洪霓　王国平　王利平

摘 要：【目的】为了对我国梨腐烂病病原菌进行初步鉴定和序列分析，【方法】从我国15个省（市）梨产区采集腐烂病样品并观察其田间危害症状，通过组织分离法分离获得168份梨腐烂病菌分离株，从中选取72份进行单孢纯化，共获得79份梨腐烂病菌纯化分离株；观察在PDA、25 ℃黑暗条件下病原菌菌落形态以及产孢体形态，并对其在梨枝条上产生的分生孢子器徒手切片置显微镜下观察其结构特征和分生孢子形态；采用菌丝块接种法测定梨腐烂病菌在‘翠冠梨离体枝条上的致病力。对部分菌株rDNA-ITS进行PCR扩增、测序，利用BLAST软件与GenBank数据库进行序列相似性分析，并用MEGA 4.1和邻接法构建系统发育树。【结果】根据梨腐烂病菌各分离株在PDA上的菌落形态特征可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种菌落类型，不同梨腐烂病菌分离株在PDA上产生多种类型的产孢体，不同梨腐烂病菌菌株在离体梨树枝条上的致病力存在差异，我国梨腐烂病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率为99.98%～100%，与苹果腐烂病菌分别聚在同一亚组的两个分支。【结论】我国梨腐烂病病原菌存在不同的菌落类型，其rDNA-ITS核苷酸序列分析显示均为V. mali var. pyri。

关键词： 梨腐烂病； 苹果腐烂病； rDNA-ITS； 致病力

中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0140-07

梨腐烂病（Valsa canker of pear）又名烂皮病，主要危害梨树的主枝和侧枝，导致梨树势衰弱，果实产量和品质下降。该病具有发生区域广、发病率高、难以控制的特点。在我国梨主产区均有发生，尤以新疆、西北、华北、东北等地发生严重[1]。发病严重的梨园，树体病疤累累、枝干残缺不全，造成大量死树或毁园。目前国内外对梨腐烂病病原菌种类及其归属尚未十分明确，起初，我国学者根据病原菌的形态学特征鉴定为梨黑腐皮壳菌[Valsa ambiens （Pers.） Fr.][2-3]，后来通过比较其与苹果腐烂病菌形态学性状以及酯酶同工酶谱和致病性方面的异同，认为梨腐烂病菌是苹果黑腐皮壳梨变种（Valsa mali var. pyri）[4]。日本学者Kobavashi[5]认为V. mali与V. ceratosperma是同一种菌的两个异名。在很长的一段时间内，V. mali和V. ceratosperma 均被用作梨和苹果腐烂病菌的名称[6-9]，之后更多采用V. ceratosperma。王旭丽等[10]通过对病菌的ITS序列测定分析并结合培养特征鉴定认为，梨腐烂病菌和苹果腐烂病菌可统称为V. ceratosperma。WANG等[11]认为V. mali是引起我国梨腐烂病和苹果腐烂病的主要病原菌，V. mali中又分为两个变种，梨腐烂病菌为V. mali var. pyri，它既可以引起梨腐烂病也可以引起苹果腐烂病；苹果腐烂病菌为V. mali var. mali，它则主要是引起苹果腐烂病。此外苹果腐烂病的病原除了V. mali外，还发现少部分为V. malicola。

研究通过对我国梨产区梨腐烂病的调查、采集、分离获得梨腐烂病菌分离株，对其进行生物学特性的观察、致病力的鉴定、测定并分析其rDNA-ITS基因序列，分析我国梨腐烂病病原菌分离株的生物学特性与其基因组rDNA-ITS基因序列是否存在相关性，我国梨腐烂病菌不同分离株致病力的差异与寄主种类及地理来源之间是否存在相关性，旨在明确我国梨腐烂病病原菌的种类组成。

1 材料和方法

1.1 材料

2010年5月至2012年5月，依托于国家梨产业技术体系21个综合试验站，根据梨树腐烂病在田间的病害症状特征，在我国15个省市（黑龙江、辽宁、吉林、新疆、河北、北京、山西、陕西、甘肃、山东、河南、湖北、安徽、福建、云南）的梨产区采集梨腐烂病病样，共分离获得168份梨腐烂病菌株（表1）。另从山西苹果树腐烂病病样上共分离获得7份苹果腐烂病菌株作为参照菌株。

1.2 方法

1.2.1 病原菌株的分离、纯化 采用常规组织分离法[12]，从病斑边缘病健交界处取样分离、培养获得梨腐烂病菌分离株。选取不同省份部分分离株在25 ℃、黑暗条件下于PDA平板上进行培养至产生分生孢子角，挑取分生孢子角制备孢子悬浮液涂于PDA平板上培养，孢子膨大后挑取单孢置于新的PDA平板上培养获得纯化菌株[13]，将纯化菌株保存于PDA斜面试管中，于4 ℃贮存备用。所有病样及菌种保存于华中农业大学果树脱毒种质资源室内保存中心。

1.2.2 病原菌株形态观察 将接种不同纯化分离株的PDA平板置于25 ℃、黑暗条件进行培养， 观察菌落的颜色、形状、气生菌丝的疏密程度和产孢体的形态特征，记录产孢体的大小及分布情况。将病菌在PDA平板上培养至产生分生孢子角，挑取分生孢子角制备孢子悬浮液涂于PDA平板上于25 ℃、黑暗条件下培养，观察孢子萌发特征。

选取梨1 a生离体枝条，将梨腐烂病菌接种枝条上（用直径为5 mm的打孔器在梨枝条上打孔，将用同样大小打孔器打孔获得的菌丝块接种其上，保鲜膜覆盖保湿），待发病3周后，发病枝条上产生黑色小点，挑取黑点制作徒手切片，置光学显微镜（NIKON JAPAN）下观察其形态特征并拍照、记录。

1.2.3 致病性测定方法 将‘翠冠梨离体1 a生枝条用清水洗净晾干，再用酒精消毒并晾干，将其剪成约15 cm长的小段，两端用石蜡封口。用直径为5mm的打孔器在小段枝条的中央打孔，从各分离株在PDA平板上生长2 d时的菌落边缘打取大小一致的菌丝块进行接种，同时用接种空白PDA培养基的枝条作为对照，然后附上灭菌湿棉花并将其置于用酒精消过毒且铺有灭菌湿纱布的白色塑料盘中，用保鲜膜封口，将其置于25 ℃、光暗交替（12 h/12 h）环境下，每份菌株4次重复。培养至2 d，将棉花和菌丝块去掉并观察其发病情况，培养至4d，调查、记录枝条发病状况，测定病斑长度。数据分析采用SPSS软件分析，处理间的差异显著性采用Duncans Multiple Range Test。

1.2.4 DNA的提取 将菌株转入铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央培养，3 d后收集菌丝，液氮研磨，采用CTAB法[14]提取其基因组DNA。1%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量并估计其浓度。

1.2.5 rDNA-ITS基因的扩增、克隆及测序 以梨腐烂病菌分离株基因组DNA为模板进行rDNA-ITS基因的PCR扩增。采用引物为真菌基因组转录间隔区通用引物ITS1和ITS4[15]，ITS1：5-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3。rDNA-ITS区域PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；进入循环94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

纯化的PCR产物连接到PMD18-T载体（TaKaRa），转化到E.coli 菌株DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB平板上，37 ℃培养过夜，挑选单菌落， PCR扩增鉴定阳性克隆，由南京金斯瑞生物技术有限责任公司自动测序仪进行测序。在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST中搜索黑腐皮壳属及相近属真菌的分离物，与本研究测定的腐烂病菌分离株的ITS基因区域序列进行比较分析。采用DNAMAN、Clustalx W（1.83）（http：//clustalw.genome.jp） 软件对其核苷酸序列进行多重比对和分析，遗传进化分析软件MEGA 4.1，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树， 重复1 000次[16]。

2 结果与分析

2.1 田间腐烂病症状观察结果

梨腐烂病危害梨树主干、主枝、侧枝及小枝的树皮，致使树皮表现腐烂症状。病皮外观初期红褐色，水渍状，稍隆起，用手按压有松软感，多呈椭圆形或不规则形，常渗出红褐色汁液，有酒糟气味。用刀削掉病皮表层，可见病皮内呈黄褐色，湿润、松软、糟烂（图版-A1）。发病后期，表面密生小粒点为梨腐烂病病原菌的分生孢子器，刮开病斑表皮可见分生孢子器暗褐色、锥形、埋生（图版-B1），分生孢子器多腔室，形状不规则，器壁暗褐色，有一共同孔口，孔口处黑色，通到表皮外（图版-C1）。雨后或空气湿度大时，从分生孢子器中可涌出病菌淡黄色的分生孢子角（图版-D1）。

2.2 梨腐烂病菌形态特征观察结果

选取来源于不同地区的72份梨腐烂病菌分离株进行单孢分离、纯化培养共获得79份菌株。将其在PDA平板25 ℃、黑暗条件下培养至5 d进行菌落形态观察，可将梨腐烂病菌分为2种不同的菌落类型，分别称为Ⅰ型和Ⅱ型；其中Ⅰ型菌落类型72份，Ⅱ型菌落类型7份。Ⅰ型菌落在PDA上培养至5 d时表现为菌落羽状、乳白色、质地柔韧、结构致密，并具有乳白色的气生菌丝，在菌丝的生长过程中分泌胶状物质使菌丝紧贴培养基生长（图版-A2）；5 d后培养至20 d，菌株的培养基颜色均为乳白色。Ⅱ型菌落在PDA上培养至5 d时表现为菌落羽状，菌丝乳白色，质地柔韧、结构致密，分泌胶状物质和色素，色素使培养基呈现黄绿色（图版-B2）；Ⅱ型菌株培养至20 d时，分泌的色素使PDA培养基显现出浅黄色、橙黄色、灰色、黄褐色的变化。

对梨腐烂病菌菌株在PDA上培养产生的产孢体形态及分布情况进行了观察记录，结果表明梨腐烂病菌在PDA上培养至40 d时，菌株出现菌丝团或不同类型的产孢体，分别称为A、B、C、D、E、F、G和H型（图版-A3， B3， C3， D3， E3， F3， G3， H3）。A型为菌株产生菌丝团；B型产孢体大小在0.8～2.8 mm之间，外围分布的产孢体密集且大小均有，分布于培养皿中心的产孢体大而疏散；C型产孢体大小在0.1～0.2 mm之间，在整个皿中均匀密集分布；D型产孢体大小在0.1～2mm之间，稀疏分散分布；E型产孢体大小在0.1～4mm之间，大多数产孢体集中在3.5 mm左右，稀疏均匀分布；F型产孢体大小在0.1～1.5 mm，小产孢体均匀密集分布，大产孢体均匀稀疏分布；G型产孢体大小在0.5～2.2 mm，它们集中在2 mm左右，呈中央密集，边缘稀疏分布；H型产孢体大小在0.2～0.8 mm，稀疏分散分布。B、E、F、G

型产孢体均在培养基上形成，前期分泌灰绿色透明的黏状物，后期孔口处被菌丝包住呈半包埋状，有多个孔口，形成白色球状的产孢体。C、D型产孢体均在培养基表面形成，先形成小的菌丝团，后期逐渐露出黑色小点。H型产孢体成黑色的小点，一般是2～3个小点聚在一起。

对梨腐烂病菌在PDA培养基上分子孢子动态变化进行了观察，结果表明分生孢子香蕉形，大小为 3.5～8 μm×0.65～1.2 μm。分生孢子萌发时先膨大，至12 h左右时，有些分生孢子可膨大至原孢子大小的数倍，成球形或近似球形，至48 h左右膨大的孢子向外伸出芽管，伸出芽管的数目为1～4根。对梨腐烂病菌接种在梨树枝条上产生的黑点进行了徒手切片显微观察，结果显示腐烂病菌的分生孢子器具有多个腔室，共用一个孔口，集于分生孢子器中央，腔壁内部凹陷，形成多个小室。

2.3 来源于我国不同梨产区的梨腐烂病菌rDNA-ITS基因核苷酸序列分析

选取我国不同梨产区的38份梨腐烂病菌分离株和7份苹果腐烂病菌分离株进行rDNA-ITS基因的PCR扩增，电泳检测结果表明：38份梨腐烂病菌分离株和7份苹果腐烂病菌分离株的rDNA-ITS序列扩增均得到大小约为544 bp的特异性片段，与预期目标片段大小一致，而阴性对照无任何条带。

将来源于我国12个省（市）（黑龙江、云南、安徽、河北、辽宁、新疆、甘肃、北京、山西、山东、河南、福建）梨产区的38份梨腐烂病菌株以及来源于山西、山东的7份苹果腐烂病菌株，并选取有代表性的在GenBank上登录的来源于不同国家地区、不同寄主的腐烂病菌株基因核苷酸序列进行系统进化树分析，结果表明：来自我国的38份梨腐烂病菌株其rDNA-ITS核苷酸序列一致率为99.98%～100%，与来源于意大利的梨树腐烂病菌（GenBank， Acc.No.， DQ241769）聚为同一分支为V. mali var. pyri[11]（图1）；来自山东烟台、山西运城苹果树上的7份苹果腐烂病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率为100%，并与来源于日本的苹果树腐烂病菌株（GenBank， Acc.No.， AF192326）聚为另一分支V. mali var. mali[11]（图1）。这2个分组之间的菌株有7个碱基的差异，但它们同属于V. mali组。来自不同国家和地区（日本、乌干达、美国、南非）以及不同寄主（桉树、橡树、桃）来源的腐烂病菌株与来自我国梨树和苹果树寄主上的腐烂病菌分别聚为不同的亚组，其中来自不同地区的桉树寄主上的腐烂病菌聚为同一亚组，来自不同地区桃树寄主上的腐烂病菌聚为同一分支，来自橡树寄主上的腐烂病菌自成一个独立分支，而我国的梨树和苹果树寄主上的腐烂病菌聚为同一个亚组，表明腐烂病菌菌株与地域、寄主种类间存在一定的相关性。

2.4 梨和苹果腐烂病菌致病性测定结果

将梨和苹果腐烂病菌接种‘翠冠梨离体枝条，接种1 d后均开始发病，4 d时梨腐烂病菌在枝条上形成溃疡状病斑，病斑中间呈红褐色，边缘黑褐色，组织软化；苹果腐烂病菌在枝条上形成黑褐色溃疡斑，病斑处表皮均因为失水而皱缩（图版-A4， B4， C4， D4， E4， F4， G4）。采用SPSS软件对梨腐烂病菌菌株接种至4d的病斑长度进行显著性差异分析将我国梨腐烂病菌菌株致病力分为3个等级，病斑长度命名为LD，LD≧4.10 cm为强致病力菌株，4.10 cm﹥LD﹥2.50 cm为中等致病力菌株，LD≦2.50 cm为弱致病力菌株。按照划分标准，本研究获得强致病力菌株18份，中等致病力菌株50份，弱致病力菌株9份。来源于不同省份的Ⅰ型和Ⅱ型菌落类型的梨腐烂病菌株在致病力上均存在强、中、弱的差异。苹果腐烂病菌株的致病力在梨树离体枝条上比梨腐烂病菌株弱（图2）。

3 讨 论

本研究从我国15个省（市）的梨产区采集分离培养共获得168份梨腐烂病菌菌株，对来源于不同地区的72份菌株进行单孢分离、纯化，共获得79份梨腐烂病菌分离株。梨腐烂病菌分离株在PDA上培养的菌落形态表现为2种菌落类型，分别为Ⅰ型和Ⅱ型，均与作为参照菌株的苹果腐烂病菌在PDA上培养的菌落形态不同。对梨腐烂病菌的产孢体形态特征的观察结果表明，我国梨腐烂病菌分离株的产孢体类型存在多样性。来源于不同地区的梨腐烂病菌株以及作为参照菌株的苹果腐烂病菌株分别在‘翠冠离体梨树枝条上接种测定致病性的结果表明，梨腐烂病菌菌株产生的病斑与苹果腐烂病菌分离株明显不同，其致病力存在差异，梨腐烂病菌的致病力强于苹果腐烂病菌。本实验室还对这两种病菌在苹果枝条上接种测定了致病力，结果显示，苹果腐烂病菌的致病力强于梨腐烂病菌株。这些结果暗示，梨腐烂病菌致病力的强弱可能与寄主种类有一定的相关性。梨腐烂病菌在‘翠冠梨离体枝条上的致病力测定结果显示，来源于我国不同梨产区的梨腐烂病菌致病力的差异与其地域来源及菌落类型均无明显的相关性。深入了解我国梨腐烂病菌致病力的分化特征，还需用不同梨系统品种材料做进一步研究。

基于梨腐烂病菌分离株生物学形态特征的多样性，本研究对来源于我国梨产区腐烂病菌菌株的rDNA-ITS基因序列进行分析，结果显示来源于我国的梨腐烂病菌分离株在ITS基因进化树中聚集为独立分支，表明我国梨腐烂病菌分离株组成比较单一，均为V. mali var. pyri[11]，与苹果腐烂病菌分离株聚集为同一亚组的2个不同分支。据报道，苹果腐烂病菌分离株组成除了V. mali，还发现有V. malicola[11]，我国梨腐烂病菌分离株组成除了V. mali var. pyri，是否还存在其他病原菌，以及I型和II型梨腐烂病菌在其基因转录和表达水平上是否有差异，目前正在深入研究之中。

综上所述，本研究对来源于我国梨主产区的腐烂病菌分离株进行了田间症状特征观察、在PDA上的培养形态观察、rDNA-ITS基因序列分析以及离体梨树枝条致病力测定，初步鉴定并分析了我国梨腐烂病菌分离株病原菌种类组成，该研究结果为深入研究我国梨腐烂病发生流行规律以及防治策略的制定奠定了一定的基础。

4 结 论

通过对79份纯化菌株培养特性的观察，发现我国梨腐烂病菌存在Ⅰ型和Ⅱ型2种菌落类型，2者的致病力没有明显的差异；基于rDNA-ITS基因核苷酸序列的分析结果，我国梨腐烂病菌的分离株聚为一组，均属于V. mali var. pyri。（本文图版见封底）

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