枇杷AS—PCR反应体系的建立和优化

杨芩　付燕　王永清　陶炼　邓群仙　范建新　邓仁菊

摘 要： 【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系，为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星、‘早钟6号和‘龙泉5号为试材，通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选，并对扩增反应程序进行优化，运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为： 25 μL反应体系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+浓度2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5 U，引物0.5 μmol·L-1，模板DNA80ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72℃延伸5 min，4 ℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系，利用该体系成功确定了‘大五星的S基因型为S2-S41，其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因，它们在GenBank 上的登录号分别为JQ228451 和JX217035。

关键词： 枇杷； AS-PCR； 正交设计； 反应体系

中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0062-07

配子体自交不亲和性（GSI）在蔷薇科果树中普遍存在，是阻止自体受精，预防近亲繁殖和保持遗传变异的一种重要机制，这种特异的识别反应在遗传上受S位点复等位基因控制[1]。这主要表现为自花授粉或相同S基因型的品种异花授粉时，花粉管在花柱上部停止生长，造成自花授粉或相同S基因型品种间授粉不结实[2]。长期以来在实际生产中常依据品种间相互授粉的坐果率来选择授粉树，这种方法虽然直观有效，但费时费力，同时由于不知道品种的S基因型，选择时又具有较大的盲目性[3]。因此鉴定自交不亲和的S基因型对生产栽培选择授粉品种具有重要的指导意义。随着分子生物学的快速发展，基于S基因保守序列设计引物的S基因特异PCR分析成为一种快速、简便、可靠的S基因鉴定方法，并在苹果、梨、甜樱桃等果树上得到了广泛的应用，但未见枇杷属植物AS-PCR反应体系系统优化的研究报道。为此我们建立并优化了枇杷属植物AS-PCR反应体系，为今后开展枇杷属植物S基因鉴定，加强资源利用和指导生产选择授粉品种奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以栽植于四川农业大学园艺生物技术研究中心的‘大五星、‘早钟6号和‘龙泉5号作为研究试材，采取未完全展开的幼嫩叶片提取基因组DNA。

1.2 基因组DNA提取

按照杨芩等[4]的方法提取基因组DNA，提取物用60 μL去离子水溶解，核酸蛋白仪（Eppendorf，BioPhotometer plus）测定DNA的浓度和纯度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-20 ℃保存。

1.3 引物来源

采用Ishimizu等[5]根据梨S-RNase 基因C1 区和C5 区下游保守序列设计简并引物： 上游引物： ‘FTQQYQ： 5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3'，和下游引物： ‘FI （D/N）CP（H/R）： 5'-GYGGGGGCARTYTATGAA-3'，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 PCR扩增和优化设计

采用L25（56）正交表，参照甜樱桃[6]和苹果[7]的AS-PCR优化反应体系对影响反应较大的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行五因素五水平正交实验设计，各因素水平见表1，以空白项为误差项进行方差分析。

按表2编号加样，除表中所列因素外，还包括2.5 μL10×buffer，加去离子水补足25 μL。以‘大五星DNA为模板对以上各因素进行优化，反应程序在参照甜樱桃[6]、苹果[7]AS-PCR反应程序的基础上，初步确定为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

根据正交试验结果，选择合适的反应体系，对引物的最佳退火温度进行筛选。根据引物Tm值，设定退火温度（48～62 ℃），PCR仪（Bio-Rad公司PTC-200）自动生成12个温度梯度： 48 ℃、48.4 ℃、49.2℃、50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃、60.9 ℃、61.7 ℃、62.0 ℃。同时对循环次数、退火时间、延伸时间等影响AS-PCR反应的重要因素进行优化。

1.5 电泳结果评分及差异分析

参照何正文等[8]、付燕等[9]的正交设计直观分析方法，对3次重复PCR产物电泳结果分别评分。依扩增谱带特异性与敏感性即谱带多少、亮度的强弱和有无弥散现象评分，特异性谱带越多、亮度越强、无弥散现象评分越高，反之评分越低。最好的处理定为25分，最差的处理定为1分，以这2个处理的结果为比较标准，再将其他处理的谱带结果与这2个标准比较依次评分，评分结果用SNK法随机区组模型（DPS 7.05统计软件）进行方差分析。

1.6 S-RNase 基因克隆与序列分析

扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，Syngene 凝胶成像系统观察拍照。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），对PCR产物目的片段进行回收并连接到PGEM-Teasy （上海润成生物科技有限公司） 载体上，转化大肠杆菌，经菌落PCR鉴定，挑取阳性克隆测序（北京华大中生科技发展有限公司）。获得序列分别利用国家生物技术信息中心（NCBI）的Blast和Nucleotide 软件进行同源性序列检索与序列登记。

2 结果与分析

2.1 正交设计试验结果的直观分析评分及差异分析

按表2的5因素5水平正交设计25个处理进行PCR反应后，将得到的产物进行电泳，其中1次重复电泳图谱如图1所示。不同Taq酶用量、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板用量扩增的结果各不相同。各处理的直观分析评分结果如表3所示。

采用DPS 7.05统计软件运用SNK法随机区组模型对各处理直观分析评分进行方差分析，结果如表4所示。由F值可知，Mg2+对反应影响最大，Taq酶影响最小，各因素水平变化对PCR反应影响大小依次为： Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶。由于各因素水平间对AS-PCR扩增结果的影响差异显著，进一步在因素内进行多重比较。

2.2. 各因素对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响

2.2.1 Mg2+浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响 从表4中可以看出，PCR扩增结果受Mg2+浓度影响最大。从图2可以看出，随着Mg2+浓度增加，直观评分结果均值总体呈先增加后下降的趋势，当Mg2+浓度增加到2.0 mmol·L-1时，扩增结果均值最大，当Mg2+浓度增加到2.5 mmol·L-1时，扩增结果均值迅速下降。Mg2+各浓度间多重比较结果表明，25 μL体系中，各浓度间直观评分结果差异极显著。反应液中的Mg2+浓度直接影响Taq酶活性，过低的Mg2+浓度使得Taq酶活性不能有效发挥，进而影响引物与模板的结合；而过高的Mg2+浓度又使得Mg2+与底物竞争Taq酶，抑制了酶的活性。因此，确定合适的Mg2+浓度对AS-PCR反应至关重要。根据电泳图谱与评分结果分析可知，适宜的Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1。

2.2.2 Taq酶浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响 从方差分析可知Taq酶对AS-PCR反应影响最小（表4），这与图3中Taq酶用量间的直观评分结果变化幅度一致。Taq酶因素内各水平多重比较结果表明，Taq酶用量为1.5 U时扩增结果显著好于其他各用量，其他用量间差异不显著，综上认为在25 μL 反应体系中1.5U Taq酶用量为枇杷AS-PCR反应的适宜参数。

2.2.3 引物浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响 引物浓度对枇杷AS-PCR扩增产物有较大的影响（表4），引物多少关系到扩增产物的质与量，浓度太低不能进行有效的扩增，浓度太高会增加错配，增加非特异性扩增和引物二聚体的形成，导致扩增产物不是所需的特异性产物，或条带不稳定及清晰度下降。随着引物浓度增加，扩增结果直观评分均值逐渐增加，当引物浓度为0.5 μmol·L-1时，扩增结果均值最大，当引物浓度增加为0.6 μmol·L-1时，扩增结果均值迅速下降。引物因素内各浓度间多重比较结果表明，浓度为0.5 μmol·L-1时扩增效果显著好于其他浓度，因此选择引物浓度为0.5 μmol·L-1为本实验的反应参数。

2.2.4 模板浓度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响 由方差分析可见，模板对枇杷属植物AS-PCR反应影响较小，在40～80 ng内扩增效果均较好（图5）。DNA因素内各用量多重比较结果表明，当模板DNA用量为80 ng或120 ng时扩增效果较好，并显著好于其他用量处理，因此确定80 ng模板用量为本实验的反应参数。

2.2.5 dNTPs对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响 由方差分析可见，dNTPs的用量对枇杷AS-PCR反应影响仅次于Mg2+。直观评分结果均值显示，在dNTPs浓度为0.40 mmol·L-1时就有较好的扩增结果，因素内各浓度多重比较结果表明（图6），dNTPs浓度为0.40 mmol·L-1时扩增结果显著好于0.60 mmol·L-1、0.80 mmol·L-1、1.00 mmol·L-1 3个浓度处理，虽然当浓度增加至1.20 mmol·L-1时的扩增结果最好且显著好于其他浓度处理，综合考虑扩增效果和节约成本，选择dNTPs浓度0.40 mmol·L-1为本实验的反应参数。

2.3 退火温度对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响

AS-PCR引物序列一般由18～30个碱基组成，并且不同特异引物的GC含量差异较大，造成不同引物最佳退火温度差异较大。图7所示为退火温度对本实验所用引物组合的影响电泳图谱。一般而言，退火温度偏低，背景模糊，同时非特异带扩增增加，给试验结果分析带来极大的困扰；退火温度逐渐升高，可以减少不匹配的杂交，从而非特异性带扩增逐渐减少，背景也逐渐清晰，扩增出的特异性带整齐明亮，但如果退火温度过高，扩增条带少会使某一特异性条带无法扩增，这也会对试验结果分析造成较大的困扰，因此筛选不同引物组合的最适退火温度对枇杷AS-PCR反应至关重要。本实验所用引物组合（图7），当退火温度低于54 ℃时，扩增条带明显增多，许多大分子质量片段得到扩增，但背景较模糊，进一步的试验分析与处理；当退火温度高于54 ℃时，特异性条带逐渐减少，最后不能扩增出特异性条带。因此，综合考虑扩增的完整性和清晰度，本实验引物组合最佳退火温度确定为54 ℃。

2.4 退火时间对枇杷属植物AS-PCR反应的影响

实验设置了25 s、30 s、40 s、50 s 4个退火时间对最佳退火时间进行筛选，结果表明退火时间为25 s时，扩增条带有缺失，特异性带扩增量较少且有弥散现象；适当延长退火时间，扩增条带逐渐增加，特异性带扩增效率增高，弥散现象逐渐消失；但如果退火时间继续延长可能增加错误匹配的可能性和引发错误杂交，会增加非特异性带的扩增，降低特异性带的扩增效率，特异性条带变弱。退火时间为30 s时，扩增条带完整清晰（图8），因此，本实验退火时间为30 s。

2.5 循环次数对枇杷属植物AS-PCR反应体系的影响

循环次数对扩增产物的量具有重要影响，且不同植物、不同PCR适合的循环次数不同。循环次数不够，获得的扩增产物少，部分特异性谱带不能得到有效扩增；过多的循环次数可导致发生错配的比例上升，容易扩增非特异性的产物，引起弥散现象，对试验结果进一步分析造成干扰。本实验研究了30、35、40次循环对枇杷AS-PCR反应的影响，电泳图谱如图9所示，30次循环时，扩增产物不足，条带弱且有缺失；35次循环扩增谱带亮度高，清晰度好；而40次循环时出现了一些非特异性谱带，同时有弥散现象，条带不清。因此确定35次循环为本实验的最适反应循环参数。

通过实验分析，优化枇杷属植物AS-PCR反应体系，在25 μL反应体系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5U，引物0.5 μmol·L-1，模板80 ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。

2.6 ‘大五星枇杷S基因型确定及新S-RNase基因的鉴定

采取上述优化体系，用上述兼并引物对‘大五星、‘早钟6号和‘龙泉5号3个品种进行AS-PCR扩增结果如图10所示，扩增谱带清晰，能有效扩增S等位基因特异性谱带。在‘大五星中扩增出的600～700 bp谱带进行回收与克隆，测序后获得654 bp的序列，Blast同源序列检索表明，该序列与已登记的枇杷属植物S2等位基因（GenBank： GU384665.1）同源性为99%，在GenBank上的登录号为JQ228451。

此外，核苷酸序列分析发现，‘大五星中扩增出的768 bp谱的序列（暂命名为SX）与GenBank中枇杷S1-RNase基因（GenBank： EU442285.1）的核苷酸序列同源性为96%。由推导氨基酸序列比对分析（图 11）可知，Sx与S1-RNase共有10处氨基酸替换及4处氨基酸插入，其中2处氨基酸替换及所有氨基酸插入位置为鉴定S基因的HV区，因此可以确定Sx为枇杷的新S基因，命名为S41-RNase（GenBank： JX217035），并确定‘大五星的S基因型为S2-S41。

3 讨 论

AS-PCR方法在鉴定蔷薇科植物的S-RNase 基因中得到广泛的应用[3]。虽然与RADP、ISSR与S-SAP等PCR反应一样，AS-PCR反应受体系各成分浓度、引物退火温度与时间、循环次数等反应程序因素的影响[6]，但AS-PCR是根据等位基因多态性设计一系列等位基因特异引物进行的PCR扩增[10]，其扩增谱带较少且具有特异性，对影响反应的因素变化更为敏感。本实验中Mg2+浓度对扩增结果影响最大，其次是dNTPs浓度，虽然dNTPs是PCR反应的原料，但从筛选出的最适浓度来看，dNTPs的浓度较低为设置的最小水平0.4 mmol·L-1，其浓度升高可能降低了反应液中自由Mg2+的浓度而影响了酶的活性，从而影响了扩增结果[11]。

S基因特异PCR一般分别以多个等位基因的保守区和某一S基因的多态位点设计兼并引物和特异引物，引物间GC含量差异较大，且引物序列长度不一。因此对引物的最适退火温度进行筛选十分重要，本研究采用温度梯度PCR方法寻找所用引物组合的最适退火温度，表明在一定的温度范围内，退火温度低扩增的条带多，非特异带较多，不利于特异条带的回收，温度升高非特异扩增减少，特异带扩增增强，这与付燕等[9]和胡甦等[11]在ISSR反应体系中的研究结果一致。

本研究采用正交设计对影响PCR反应的关键因素水平进行综合筛选，运用得到的优化体系对‘早钟6号、‘大五星和‘龙泉5号 3个品种进行了S等位基因进行了扩增，得到的扩增谱带清晰且稳定，重复性好，扩增出的S等位基因特异条带整齐性较好，有利于进一步开展回收及克隆工作。本研究基于梨S等位基因保守序列设计引物建立的枇杷属植物AS-PCR反应体系填补了枇杷属植物S等位基因特异PCR快速鉴定的技术空白，为枇杷属植物种、品种S基因的快速鉴定及序列分析奠定了技术基础。

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