‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选

王梨嬛　潘永娟　杨莉　蔡盛华　黄新忠

摘 要：【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚的管家基因，并筛选合适的管家基因作为内参，【方法】以‘琯溪蜜柚盛花期后5个不同时期的果实汁胞，以及根﹑茎﹑叶为材料，采用实时荧光定量PCR技术，分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 个管家基因在不同材料中的表达情况，并结合 geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明， actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚果实发育进程中较为稳定的内参基因，而 EF1-α和β-tubulin 则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚最佳的内参基因β-tubulin，为今后目的基因的表达分析奠定了基础。

关键词： ‘琯溪蜜柚； 荧光定量PCR； 内参基因

中图分类号：S666.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0048-07

实时荧光定量 RT- PCR（ real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR， qRT- PCR ）是在传统 PCR 技术基础上发展而来的一种新型、高效的核酸定量技术，实现传统 PCR 从定性到定量的飞跃，具有实时性、速度快、高通量及自动化程度高等特点，目前已广泛应用于分子诊断、生命科学、农业及医学等领域的基因表达、DNA/RNA 拷贝数检测，以及单核苷酸多态性等方面的研究[1-4]。

基因表达分析已广泛应用于生命科学众多研究领域，对发现和预测新基因及其功能、了解基因调控的复杂网络等有重要作用。在基因表达研究中，要精确判断特定靶基因表达的水平，需要有一个稳定表达的内参基因将未知样本总核酸量标准化[5]。目前一般选择管家基因作为内参，但很多管家基因随环境、物种、组织来源及试验条件等改变，其表达水平也有所变化[6]。因此，针对特定试验条件和样品选择合适的内参基因对靶基因进行标准化，是获得准确基因表达结果的重要前提[7-8]。

‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]属亚热带常绿乔木果树，是我国特有的柚类良种，以其皮薄、肉嫩、汁多、酸甜适口等优良品质而享誉海内外，具有较高的经济价值。目前，运用生理和分子生物学手段研究柑橘类各种次生代谢产物的调控及其机制已经成为研究热点[9-17]。本研究应用 qRT- PCR 技术及 4 种可行性方法评估 5 个内参基因的表达稳定性，筛选‘琯溪蜜柚不同果实发育时期及不同组织最适的内参基因。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本实验以 2008 年和 2009 年的‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]盛花期后（ days after flowering， DAF ）45、75、105、135、165 d 的果实汁胞，以及根﹑茎﹑叶组织为材料，每份材料重复 3 次取样。所用材料由福建省农科院果树所提供，样品采集后于 -80 ℃ 冻存备用。本试验所使用的实时荧光定量 PCR 仪为 Applied Biosystem 公司 StepOne PlusTM PCR 仪，PCR 管为 Applied Biosystem 公司配套的 8 连管和管盖。FS Universal SYBR Green Master 试剂盒购自 Roche 有限公司，引物由上海英潍捷基有限公司合成。其他常规试剂分别从北京科百奥生物科技有限公司与金华医药公司购买。

1.2 RNA 提取及cDNA 一链合成

参照徐昌杰等[18]的改良 Bugos 法提取样品总 RNA，提取的总 RNA 经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质量与浓度。

取 1 μg 总 RNA，参照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas 公司）使用说明合成 cDNA 一链，保存于 -20 ℃ 备用。

1.3 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 内参基因片段的克隆

在 NCBI 网站搜索内参基因 actin1、β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 序列，选取与柚亲缘关系较近物种的保守序列设计引物（表 1），以‘琯溪蜜柚 DAF 165 果实汁胞 cDNA 一链为模板，采用高保真 Taq DNA 聚合酶分别扩增上述 5 个管家基因，并连接至 pEASY-Blunt 平末端克隆载体，获得的克隆送上海英潍捷基有限公司测序验证。

1.4 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 内参基因 qRT-PCR 引物设计

参照实时荧光定量 PCR 引物设计原则，以克隆的 5 个‘琯溪蜜柚内参基因片段为模板，应用 Primer Premier 5.0 软件，设计 qRT-PCR 反应引物（表 2）。

1.5 内参基因的 qRT-PCR 分析

qRT-PCR反应体系中分别加入2 × SYBR Green 10 μL、10 μmol·L-1 forward primer 0.4 μL、10 μmol·L-1 reverse primer 0.4 μL、cDNA一链模板（稀释15倍）1 μL，添加ddH2O 补足至总反应体系 20 μL。每样品重复3次。qRT-PCR反应条件为：95 ℃ 预变性 5 min，95 ℃ 3 s，退火及延伸 45 s，40次循环。反应结束后进行熔解曲线分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定产物的特异性。

1.6 数据分析

利用 EST Database of Cotton 网站（http：//www.leonxie.com/referencegene.php）中内参分析软件进行数据在线处理，该在线软件共包含 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 种内参基因评估方法，对各个内参基因的表达稳定性进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品总 RNA 质量检测

如图 1所示，所提取的 RNA条带清晰明亮，28S RNA 条带荧光亮度是 18S RNA 条带的 1.5～2.0 倍，没有蛋白质、多糖、盐或其他杂质的污染，可用于后续试验。

2.2 内参基因片段的克隆

经测序验证5 个‘琯溪蜜柚内参基因片段均与其他物种对应序列有较高的同源性，表明所克隆片段为‘琯溪蜜柚相应的内参基因。将获取的内参基因片段序列提交至NCBI 网站，获取GenBank登录号分别为：actin1（JQ248013）、18S rRNA（JQ343046）﹑ EF1-α（JQ353767）和 Ubiquitin（JQ343045），另外 β-tubulin序列已由福建农林大学的Chen和Yang提交至NCBI，序列号为 JN580588。

2.3 普通RT-PCR预扩增内参基因片段

以 DAF 165 果实汁胞 cDNA 一链为模板，应用荧光定量 PCR 引物分别扩增 actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 个内参基因片段。如图 2 所示，5 个内参基因均能扩增出特异条带，与预期片段大小一致；无引物二聚体，表明引物特异性较好，可用于后续 qRT-PCR 分析。

2.4 qRT-PCR扩增内参基因片段

以‘琯溪蜜柚果实不同发育时期汁胞及组织 cDNA 一链为模板，进行 qRT-PCR 分析。如图 3 所示，‘琯溪蜜柚 5 个内参基因在不同样品中溶解曲线均呈单一信号峰，表明所用引物均能特异地扩增相应内参基因，不存在引物二聚体；并且重复之间差异小（ Ct 值差异小于1）。同时，分别对 5 对引物的 qRT-PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果每对引物均能扩增出预期大小的特异条带（结果同图 2）。上述结果表明，本实验中实时定量 RT-PCR 结果是准确可信的，最终取 3 次重复的平均 Ct 值用于后续数据分析。

2.5 内参基因的分析选择

“EST Database of Cotton”是一在线数据库，在其“softwares and tools”栏有关于内参基因稳定性和变异系数的评价系统，该系统包括 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 种用于筛选稳定的 qPCR 内参基因数据分析方法。如图 4 A 所示，除 BestKeeper 法分析 18S rRNA 是相对较稳定的内参基因之外，其余3种方法均判断 actin1 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果实发育进程中较为稳定的内参基因；EF1-α 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚不同组织中较稳定的内参基因图 4 B。

3 讨 论

实时荧光定量 PCR 技术现已成为分子生物学研究的重要工具，要想获取确实可信的基因表达结果，需要有合理可行的实验设计、严格精准的实验操作、较高的 RNA 质量和逆转录效率、引物设计及正确的数据分析等。除此之外，还需选择稳定的内参基因。大量的研究结果表明，不同植物的最合适的内参基因均不相同，且同一植物不同组织之间内参基因的稳定性也存在一定差异。盲目地使用一种管家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能产生错误甚至相反的结论[1，7-8]。因此，适宜内参基因的选择应取决于研究者的实验条件，在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用另一种实验条件，不同植物间内参基因也是不同的。在研究目的基因表达丰度之前，有必要对内参基因的表达稳定性进行评价，并选出适合在不同实验条件下使用的内参基因。理想的内参基因应满足以下条件：（1）无假基因；（2）稳定表达于不同类型的细胞或组织，且表达水平相近，无显著性差别；（3）表达水平与目标基因相似；（4）不受任何内源性或外源性因素的影响[7，19-20]。事实上，所有基因在不同细胞或组织中、细胞的不同生理时期、不同外界刺激条件下，其表达丰度都会有所改变，甚至是几十倍、上百倍的差异[8，19]。

另外，不同的评估方法对实验结果也有一定的影响，需运用多种分析方法综合评估以确保准确性。在本实验中，我们应用 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 种数据评估方法，分析发现其中BestKeeper 数据评估结果与前 3 种方法略有差异，其可能的原因是： 在试验中18S rRNA 表达量相对较高，Ct 值显著低于其他内参基因，经 BestKeeper 分析得出的 CV 值也相对偏小。由于 geNorm 软件将每个候选内参基因与其他内参基因的配对表达水平比值经过对数转换，计算标准差，更适用于准确定量的内参数目[21]。

植物分子生物学研究领域有大量关于内参基因筛选的研究，其中在模式、经济作物中研究较多，如拟南芥、水稻、番茄、油菜等[22-25]，也发现并鉴定出新的一些内参基因，如UNK1、MTP、FBOX、PP2A和 rpII 等。至于柑橘类，Mafra等[26]从 15 个候选基因中发现 FBOX、SAND、GAPC2 和 UPL7 适用于甜橙 （C. sinensis Osbeck） 等 7 种柑橘基因型及生物胁迫处理材料的基因定量分析。严佳文等[27]分析发现 ACTB 在沙田柚 （C. grandis Osbeck） 等 6 种柑橘基因型叶片中表达较稳定，18S rRNA 和 rpII 在花瓣和果皮中表达相对稳定。本研究发现 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织中均较为稳定的内参基因，而 actin1 和 EF1-α 则分别适用于‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同组织的基因定量分析。

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