内分泌干扰物对雌激素受体信号通路的影响

张育辉，肖 宁，李忻怡

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

随着化学工业的快速发展，化学产品向环境中 的排放量随着生产总产量的上升在急剧增加．环境中部分化合物可通过干扰机体内源激素的某些信号途径影响动物或人体正常的激素平衡，此类化合物称内分泌干扰物（endocrine disruptive chemicals，EDCs）．不同EDCs的作用途径存在差异，但它们最终均通过干扰正常的激素水平，产生激素效应．在机体中，与其他类固醇激素一样，雌激素反应由雌激素受体（estrogen receptor，ER）介导，雌激素与ER结合后进入胞核内，最终激活靶基因的转录．在人类，ER信号转导紊乱可增加患激素依赖性癌症的风险，或导致生育能力下降，或造成胎儿生长和发育异常，还可改变脂肪组织的代谢水平［1］．ER具有α和β两个亚型，二者在雌激素信号转导中发挥着既重叠又独特的生理作用．研究表明，除内源性的雌激素17β－雌二醇（E2）能与ER结合外，许多外源性配体具有类似于E2与ER的亲和力，它们同样能够选择性地与ERα或ERβ结合［2］．目前已知，EDCs既可以通过与ER直接作用，也可以通过与芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）等转录因子作用，间接改变基因组或非基因组途径中ER的促转录活性．如双酚A（bisphenol A，BPA）和二乙基己烯雌酚（diethyl stilbestrol，DES）等已知的EDCs均可诱导快速的雌激素信号，对基因组或非基因组途径中ER信号转导产生影响［3］．虽然EDCs可借助多种途径干扰正常激素的功能活动，但多数EDCs的干扰机制是作为配体和ER直接结合，对ER信号转导产生影响．

1 雌激素受体

1．1 ERα和ERβ的基本特征

ER与核受体家族的其他成员有着相类似的结构，从氨基端到羧基端，ER在结构上可分为A／B、C、D、E、F 5个功能区：（1）氨基端A／B区，主要为转录激活功能域（transcription activation function－1，AF－1），是受体两个转录激活域之一，属于异变区，参与调节雌激素应答基因的转录，负责配体非依赖的转录激活功能；（2）C区为DNA结合域（DNA－binding domain，DBD），包含两个与识别激素应答元件和受体二聚体化形成有关锌指结构，能够与靶基因中的雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）结合；（3）D区为铰链域，受体在该区能弯曲、旋转以改变构象，保证以最佳的构型与配体结合，例如可与热休克蛋白结合，并具有核定位信号及稳定DNA结合功能；（4）E区为配体结合域（ligand binding domain，LBD），该功能区主要是调节配体与ER的结合、受体的二聚化、应答基因表达的激活及与辅助激活因子或辅助抑制因子的结合等；（5）羧基末端的F区是激素依赖转录激活功能域（transcription activation function－2，AF－2），AF－2的结构和功能因结合的配体类型不同而不同，负责配体依赖的转录激活功能．

ERα曾被认为是唯一介导雌激素信号的受体．自从在大鼠前列腺癌和卵巢中克隆出ERβ以来，对介导雌激素信号的受体有了新认识［4］．编码ERα和ERβ的基因在不同的染色体上［5］．ERα和ERβ的激活功能域（AF）、配体结合域（LBD）和DNA结合域（DBD）的主要差异体现在：（1）激活功能域（AF）．激活功能域AF－1和AF－2与辅助激活因子相互作用来调控靶基因的转录．N末端AF－1调控的转录不依赖于配体，但配体结合域中的AF－2以配体依赖的方式调控转录，ERα与ERβ的AF－1显著不同，二者N端氨基酸序列只有18%的同源性，与ERβ相比较，ERα的AF－1更能增强雌激素诱导的基因表达［6］．AF－2由4个α螺旋（H3，H4，H5，和H12）组成，这4个α螺旋形成疏水性凹槽，有利于与辅助调节因子的结合．（2）配体结合域（LBD）．ERα和ERβ的配体结合域氨基酸序列有59%的同源性，ER的配体结合域包含与雌激素类化合物结合的口袋结构，即配体结合口袋，但是这两个亚型在配体结合口袋中仅有两个氨基酸不同：ERα的Leu 384，Met 421分别与ERβMet 336，Ile 373不同，在与雌激素类化合物结合时，配体结合口袋的这种略微差异有助于亚型对一些化合物的选择［2］．（3）DNA结合域（DBDs）．ER在雌激素反应元件（EREs）上结合DNA后调控靶基因表达．ERα与ERβ的DBD有97%的相似性，显示其同源性很高，基因组结合位点有显著的重叠，所以ER的这两个亚型可共同调控靶基因表达．需要注意的是结合配体的ERα和ERβ能形成同源二聚体或异源二聚体，与ER同源二聚体一样，异源二聚体也能够和EREs结合［7－8］．ER异源二聚体作用的特殊性仍不清楚，因而，EDCs对ER异源二聚体活性的影响也未知．

ERα与ERβ在功能上具有既重叠又独特的生理特性，这种生理作用的差异主要表现为对细胞类型依赖性的不同，ERα在肝细胞和脑内的海马中特异表达，ERβ主要在前列腺、阴道和小脑中表达［9］．通过分别敲除小鼠ERα或ERβ的实验表明，ERα是乳腺发育中具有调控作用的主要受体，而ERβ不是这一过程和生殖发育调节的关键受体［10－11］，但它具有抑制乳腺组织细胞中ERα高表达的作用［12］．

1．2 ER信号转导通路

雌激素通过ERs调控靶基因表达发挥效应，ER对雌激素靶基因表达的调控方式有配体依赖型和非依赖型，调控雌激素靶基因表达的途径分为基因组途径和非基因组途径．基因组途径包括ER和DNA的直接作用和通过转录因子与DNA的间接作用；非基因组途径是指雌激素所导致的激酶信号通路的快速激活．ER能调节多个信号通路，每个亚型可与不同的配体反应，这使EDCs对由ER介导的雌激素信号通路的作用变得相当复杂．在EDCs影响ER信号转导途径的研究中，目前对配体依赖的ER信号转导途径的比较清楚，配体非依赖的ER信号转导途径非常复杂，并涉及多种信号通路的激活，如ER与生长因子、共调解因子等通路［13］．

在基因组途径中，ER通过直接结合到EREs或借助Sp1（stimulating protein－1），AP－1（activating protein－1）等转录因子结合到EREs介导靶基因的转录［14－15］．在经典的基因组信号途径中，配体与雌激素受体LBD结合后改变ER空间构象，使ER发生二聚化，二聚化的ER结合到靶基因启动子EREs上，同时ER的两个激活功能域AF－1和AF－2结合辅助激活因子，促进靶基因的转录．研究表明，ERα和ERβ的结构特征类似，该结构有利于辅助激活因子的募集和转录输出［16－17］．内源性雌激素E2等激活因子与受体结合后，受体的构象发生改变，辅助调节因子结合位点被暴露，可见配体通过诱导受体构象的改变，使受体能募集特异性辅助调节因子，进而引起不同的反应．目前，在辅助调节因子复合物的研究中最多的核受体辅助调节因子是共激活因子p160家族，即SRC－1，SRC－2和SRC－3，调解ER活性的辅助调节因子复合物非常复杂，已有文献中描述的辅助调节因子已超过300个［18］．

在非基因组途径中，ER参与某些信号转导通路的激活，这些通路在几分钟之内即可对雌激素产生应答．ER非基因组途径的机制仍不清楚，目前研究设想与ERα和ERβ不同的膜结合ERs（membrane－associated ERs）介导非基因组途径［19］．在细胞膜上的孤儿G蛋白偶联受体30（GPR30）可介导雌激素的快速非基因组效应［20］，GPR30在结构上与ERα和ERβ不同，它能介导MAPK或PI3激酶信号通路的激活［21－22］，以及细胞内钙的波动［23］或cAMP量的增加［24］．

2 EDCs对ER的作用

2．1 EDCs对ER的直接作用

EDCs通过与内源性雌激素竞争结合ERα和ERβ的配体结合域，从而直接影响ER促转录的活性，引起雌激素效应．由于ER亚型组织分布的广泛性和雌激素作用的复杂性，使得研究EDCs对正常雌激素信号干扰的方法是多种多样的，其中最常见的是用EDCs直接影响类固醇激素受体活性，然后检测雌激素信号的变化．大部分EDCs是ER的配体，它们可以和E2竞争配体结合位点，与ER结合后，使原来结合在受体上的伴侣蛋白从受体上解离，配体的结合使ER的构象发生改变，形成二聚体，二聚化的受体与靶基因上的ERE结合，同时受体的两个功能域被激活后可结合辅助调节因子，最终介导基因的转录．研究报道，将雄性羊头鲤（Cyprinodon variegatus）暴露于辛基酚（OP）中，OP作为内分泌干扰物可直接与ER结合并激活卵黄蛋白原基因的表达，致使血浆卵黄蛋白原浓度升高［25］．通常，EDCs需要高于内源性激素100—1000倍的浓度，才能显示出与内源性激素相似的生理效应［2］．然而，EDCs在很低的浓度暴露后，可以在组织中累积，从而引起雌激素效应［26］．由于EDCs潜在的生物学作用非常复杂，并且还受组织特异性辅助因子和受体等因素的影响，所以低浓度的EDCs在有机体即可作用于ER，对机体内分泌功能产生影响．另外，EDCs也可影响ER的表达，壬基酚（NP）可激活鱼类肝细胞ER基因转录，诱导ER mRNA合成，增加ER的表达［27］．

2．2 EDCs对ER的间接作用

芳香烃受体（AhR）是一种配体激活转录因子，是细胞对外源雌激素应答的调解点，属于bHLHPAS蛋白家族，在进化上非常保守．多环芳烃类化合物（PAHs）属于一类EDCs，可作为AhR的配体激活AhR，AhR可间接影响ER促转录活性［28］．与配体结合的AhR还可能调控代谢酶基因的表达，其信号转导途径与ER信号转导途径有许多相似之处［29］．研究表明，多氯二苯并二恶英、二苯呋喃、联苯、多环芳香碳氢化合物等有机化合物可以活化AhR［30］．

2．2．1 促进ER泛素化修饰并降解 泛素化修饰的靶蛋白被26S的蛋白酶体所降解的途径称之为泛素蛋白酶体途径，该途径是真核生物体内最为重要的蛋白质降解途径．泛素蛋白酶体降解途径可以调控机体ER水平．卡林4B泛素连接酶（cullin 4B ubiquitin ligase，）是参与靶蛋白与蛋白酶体结合的多蛋白复合物，AhR和芳香烃受体核转位蛋白（ARNT）是卡林4B泛素连接酶复合物的组成部分．二恶英与AhR结合可促进泛素连接酶E3复合物（CUL4BAhR）的形成，导致ER的泛素化修饰，形成泛素链，从而被26S的蛋白酶体降解．在这个复合物中，AhR起到连接酶与ER的作用，促进了ER的泛素化修饰和降解［31］．可见泛素连接酶复合物的形成依赖芳香烃受体的配体［32］，这表明EDCs作为AhR配体，可通过与AhR的作用导致ER的泛素化修饰，并促进ER降解．早期的研究还认为AhR的配体二恶英可降解ERα蛋白质［33］．

2．2．2 与ER竞争辅助激活因子 辅助激活因子由多种蛋白家族组成，如p300、P／CAF和SRC等蛋白家族，它们可与配体激活的受体结合，从而增强受体介导的基因转录．ER和AhR介导的基因转录依赖于与转录辅助激活因子的结合，并且许多辅助激活因子通常为这两个受体共用，活化的ER和AhR可竞争结合辅助激活因子，于是EDCs通过活化AhR，使其与ER竞争结合辅助激活因子，间接影响ER的促转录活性，干扰类固醇激素信号．研究表明，哺乳动物细胞中ER和AhR辅助激活因子结合域的过度暴露会直接导致ER和AhR活性的减弱［34］．ARNT不是经典的转录辅助激活因子，但是它却具有辅助激活因子SRC家族的许多特性，而且还是雌激素受体尤其是ERβ的辅助激活因子［35］．研究表明，二恶英的抗雌激素效应与ER和AhR对ARNT的竞争有关［35－36］．此外，核受体家族其它成员间也竞争结合辅助激活因子，核受体中参与外源物质代谢的组成型雄烷受体（constitutive androstane receptor，CAR）被激活后，可通过降低p160辅助激活因子GRIP－1的水平抑制ER促转录活性［37］．

2．2．3 干扰ER介导的DNA转录 对ER靶基因启动子区的研究表明，AhR与ER之间还存在更为复杂的作用．活化的AhR能与ER靶基因启动子上游靠近ER结合位点的序列结合，把这段序列称之为抑制性外源性反应元件（inhibitory XREs）．未活化的AhR也能与ER靶基因启动子上游靠近ER结合位点的序列结合，把这段序列称之为外源性反应元件（XREs），这种结合对ER介导的基因转录的激活是必需的［38］．抑制性外源性反应元件与外源性反应元件的碱基组成略微不同，碱基的差异导致活化的AhR与抑制性外源性反应元件结合后不能激活ER介导的转录［29］．但未结合配体的AhR与外源性反应元件结合后，可激活ER介导的转录．上述表明EDCs可通过活化AhR，使其与ER靶基因上的抑制性外源性反应元件结合，干扰ER介导的转录活动．

EDCs通过AhR对ER的间接作用涉及AhR与ER间的交互对话（cross－talk）．AhR与ER间的作用非常复杂，例如，3－甲基胆蒽（3－MC）是AhR的配体，但它诱导的雌激素效应却依赖ERα而不是AhR［39］．3－MC激活ERα转录的能力与具有雌激素活性的代谢产物的转化相关．在细胞中3－MC没有参与代谢，它起着抗雌激素的效应，这与二恶英的作用类似［40］，对苯并芘（BaP）等其他AhR配体的研究也得到相似的结果［41］．细胞能把3－MC、BaP等外源物质转化成雌激素化合物，可见AhR配体的雌激素效应仍需要进一步研究．

3 总结与展望

当今，人类和动物通过空气、食物和水接触到数以千计的化学残留物，这些化学产品里有许多是EDCs，可干扰机体内源性激素的信号途径，影响动物和人体正常的激素平衡，这使EDCs受到了人们的广泛关注．EDCs可通过与ER作用影响雌激素信号转导，其作用方式有与ER的直接作用和通过AhR等转录因子对ER的间接作用，从而改变基因组和非基因组途径中ER的促转录活性．雌激素或类雌激素通过ER发挥其生物学效应，ER和EDCs对配体依赖的ER信号转导途径的作用尽管已有许多的研究成果，但是其中一些机制仍不清楚，如AhR的激活物二恶英抑制ERα信号转导的分子机制．EDCs通过AhR对ER的间接作用涉及了AhR与ER间的交互对话，由于交互对话中受到细胞环境、辅助调节因子等的影响，其分子机制目前仍不明了．EDCs对配体非依赖的ER信号转导途径的作用非常复杂，涉及多种信号通路的激活，这些途径的具体过程还不清楚．由于EDCs可能通过配体依赖或非依赖的多种信号通路直接或间接地干扰基因转录，最终影响正常的内分泌活动，所以未来的研究思路应对多种信号通路进行探讨．

ER信号转导的紊乱可引起肿瘤、心血管病、骨质疏松症等疾病的发生，因此，研究EDCs对ER信号转导途径的影响为相关疾病的治疗可提供理论依据，具有十分重要的理论意义实践价值．但是，目前EDCs对ER影响的研究大多在实验室条件下进行，而实际情况是人和动物往往长期接触低剂量EDCs，因而在ER信号转导途径方面的理论是否与实际一致，也仍需多方面的验证．

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