脂质体前体的制备及其在食品营养物中的应用

贾竞夫，忻 娜，王 燕，赵亚平*

(上海交通大学化学化工学院，上海 200240)

脂质体(liposome)是由单层或多层脂质双分子层膜包封而成的微球体，其主要成分为磷脂和胆固醇，结构类似于生物膜，双分子层内外可分别包封脂溶性和水溶性成分。脂质体最初是在20世纪60年代由英国学者将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的，并在20世纪70年代初开始被用于药物载体。脂质体具有独特的两亲性，以及良好的生物相容性和可降解性，因此在药物和食品领域有着广阔的应用前景[1]。脂质体作为药物载体，克服了不溶性药物难以被人体利用的问题，同时还有提高药物靶向作用、延缓药物作用时间、提高疗效、降低毒性、改变给药途径等优点[2]；但由于其通常以悬浮液状态存在，在物理、化学方面具有不稳定性，如团聚、沉降、降解、磷脂水解或氧化等，限制了脂质体的广泛应用。

近年来，人们提出固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)[3]、纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)[4]等来代替脂质体，以克服脂质体稳定性差的缺点。然而，SLN存在载药量过低、贮存过程中粒径增长、药物降解和突释效应等缺陷；NLC在SLN基础上采用液态油或混合脂质代替固体脂质，一定程度上提高了载药量，但其物理稳定性仍然欠佳，且不具备脂质体的双分子膜仿生结构，在生物相容度方面存在不足。相比之下，脂质体前体(proliposomes，PL)[5]则具有明显的优势，既保留了脂质体自身的优点，又提高了贮藏稳定性。

脂质体前体的概念最早由Payne等[6]在1986年提出，被定义为具有良好流动性的固体粉末状微粒，可作为药物载体，且在水中可迅速水化形成脂质体。之后，有学者将某些可在水相中短时间内形成脂质体的其他形态的脂质体系也称为脂质体前体，如磷脂的浓缩乙醇溶液[7]、混合胶体态[8]、液晶形态[9]等。与传统脂质体相比，脂质体前体不仅在物理、化学稳定性方面显著提升[10]，同时在保持给药过程中微粒的完整性、提高药物溶解性、促进药物胃肠吸收、促进药物膜渗透能力、药物动力学[11]以及提高生物利用度等方面也表现出巨大的潜力。鉴于脂质体前体独特的优势，有关其作为药物或食品载体系统的研究逐年增多，本文就近几年脂质体前体的制备方法及其应用进行综述，以期为脂质体前体的研究提供一定的参考。

1 脂质体前体的制备

目前粉末状脂质体前体的制备主要有载体沉积法、超临界流体法以及将传统脂质体制备方法同冷冻干燥或喷雾干燥技术相结合的方法；而液态或半固态的脂质体前体制备主要采用乙醇浓缩法。

1.1 载体沉积法

为了获得固体粉末状的脂质体前体，较简单的方法是可以将脂质体悬液进行加热以蒸干溶剂，即薄膜蒸发法。但脂质体悬液若直接经过旋转蒸发，会在烧瓶内壁形成薄膜状态，不易收集，且在缺少振动或超声等条件下无法在水溶液中迅速水化形成脂质体。因此，一些多孔载体的加入被用来承载和分散脂质颗粒以获得流动性好、易水合的粉末状脂质体前体。具体过程是：首先将带有药物的脂质在一定温度条件下溶于有机溶剂；然后将此有机溶液分步加入到含有载体粉末的烧瓶中，并且在每次加入脂质有机溶液后，通过真空旋转蒸发除去有机溶剂并使溶质沉积在载体上，重复进行直至所有溶液加入；在最后一次蒸干后放于干燥器中过夜，之后过筛得到脂质体前体[12]。其中载体是指具有空间孔洞结构的水溶性物质，目的是增加脂质在水化形成脂质体时的分散性，常用的载体有山梨醇、氯化钠、甘露醇、β-环糊精等。

载体沉积法在合适的条件下可制得水化后脂质体粒径在300nm以下的脂质体前体。如宋金春等[13]采用这种方法，以卵磷脂和胆固醇为脂质材料，分别优选甲醇、乙醚体积比为1：1的混合液和山梨醇作为溶剂和载体，并加入VE作为抗氧化剂制备了葛根素的脂质体前体，所得脂质体前体水化后可迅速形成平均粒径为278nm的单室或多室脂质体。使用载体沉积法制备脂质体前体的过程中，为了使有机溶剂去除充分以避免毒性，需要在旋蒸过程中少量分步加入脂质有机溶液，且通常在旋蒸完毕后要在干燥器中过夜。鉴于这一步骤的繁琐，Xu Hongtao等[14]以乙醇代替其他高毒性有机溶剂，对载体沉积法进行了改进，大大简化了制备步骤，制得的脂质体前体水合后平均粒径为300nm，包封率达到86.3%，且该脂质体前体具有较高的稳定性，氮气环境条件下室温保藏6个月后无明显变化。值得注意的是，载体沉积法制备的脂质体前体的外观(有无湿结成块、流动性等)和水化效果(水化难易、脂质体形貌等)与载体的选择密切相关。这是由于不同载体的空间结构、比表面积以及载体与脂质之间的作用力都存在差异，因此选择合适的载体对于脂质体前体的性质具有很大影响。另外，载体在使用前往往需要经过研磨、过筛等操作来达到合适的粒径，一般为几百微米，并需要进行干燥处理。

1.2 冷冻干燥法

冷冻干燥法主要是在传统的脂质体制备方法基础上，加入冻干保护剂，将脂质体冷冻干燥脱水后得到固体粉末脂质体前体。脂质体制备的方法包括乙醇注入法[15]、薄膜分散法[16]、载体沉积法制备脂质体前体后水合。冻干保护剂常用甘露醇、海藻糖、蔗糖、葡萄糖等糖类物质。冷冻干燥法又分为乙醇注入-冷冻干燥法、薄膜分散-冷冻干燥法、载体沉积-冷冻干燥法等。

1.2.1 乙醇注入-冷冻干燥法

该法将乙醇注入法制备脂质体的方法同冷冻干燥相结合，具体过程是：首先将脂质加入到无水乙醇中溶解，然后将含有冻干保护剂的水溶液加入到脂质溶液中，振荡混匀或超声，最后经过冷冻干燥获得固态粉末状脂质体前体[17]。在这一方法中，也有学者[18]使用叔丁醇代替乙醇，制备出了性能良好的脂质体前体。

1.2.2 薄膜分散-冷冻干燥法

该法将薄膜分散法制备脂质体的方法同冷冻干燥相结合，具体过程是：先将脂质、包埋物等溶于有机溶剂，然后在梨形瓶内旋蒸蒸发去除有机溶剂得到薄膜状物质，再加入水或缓冲水溶液振动得到脂质体悬液，最后超声处理后加入冻干保护剂，经冷冻干燥制得脂质体前体[19]。

1.2.3 载体沉积-冷冻干燥法

该法是在载体沉积法的基础上进一步结合冷冻干燥技术二次制备脂质体前体的方法。首先使用载体沉积法制备出脂质体前体，然后加入到磷酸缓冲液中水合形成脂质体，最后进行冻干处理，再次得到脂质体前体。有学者[20]研究指出在制备药物阿米卡星脂质体前体时，这种方法得到的脂质体前体水合后包封率比载体沉积法有显著提高，且两种方法包封率又均高于薄膜分散法制得的脂质体。该研究认为，脂质体双分子层的形成效率与脂质水合表面积的大小正相关。当干燥的脂质体前体与水接触时，载体物质(多孔糖类)溶解，使得脂质获得了更大的水合表面积，因此载体沉积法比薄膜分散法包封率更高；而经过冷冻干燥后，脂质进一步形成了膨胀、泡沫状的结构，更容易发生水合作用，从而获得了更高的包封率。尽管目前关于载体沉积-冷冻干燥法的报道不多，但这种将多种制备方法相结合的办法，在脂质体前体制备方面提供了更广阔的思路。

在冷冻干燥法制备脂质体前体的方法中，冻干保护剂的使用非常重要，直接关系到脂质体前体水合重建脂质体后的粒径和包封率等。关于冻干保护剂的作用机理目前存在两种假说[21]：一种是Crowe提出的“水代替假说(water replacement hypothesis)”，即生物体中大分子均被一层水膜保护着，干燥过程中若有冻干保护剂可与脂质体磷脂的极性基团形成氢键，脱水后代替水作为脂质体的稳定剂，保持膜的完整性。另一种是Koster等提出的玻璃化作用(vitrification)，认为保护剂的存在降低磷脂的相转变温度，阻止其从凝胶态向液晶态转变中发生药物的泄漏。冻干保护剂种类的选择也至关重要，因为不同保护剂的性质及其与所用脂质之间的作用力均不尽相同，在骨架作用和促进脂质体前体在水中的再分散方面都会带来不同影响。一般来说，冻干保护剂需要满足两个要求：1)产品外观上应饱满致密，可以形成一定硬度的饼状物；2)需要有玻璃态存在，保护脂质体膜不致受到结晶的机械破坏。Liu Yang等[22]在制备载基因纳米阳离子脂质体前体的过程中，对9种冻干保护剂从成型性、复溶情况、粒径、载药量等方面进行了考察，得出海藻糖、甘露醇、甘氨酸效果较好，其中海藻糖复溶后澄清透明、载药量最高。

1.3 喷雾干燥法

与冷冻干燥法类似，喷雾干燥法也是在传统脂质体制备方法基础上，配合喷雾干燥技术得到固体粉末状的脂质体前体，有时需要在喷雾干燥前加入热保护剂。主要有乙醇注入-喷雾干燥法、薄膜蒸发-喷雾干燥法、流化床法等方法。

1.3.1 乙醇注入-喷雾干燥法

该法首先将脂质加入到无水乙醇中溶解，然后将缓冲水溶液加入到脂质溶液中，振荡混匀或超声，最后经过喷雾干燥获得固态粉末状脂质体前体。在有效克服喷雾热效应的情况下，该方法制得的脂质体前体水合后可形成粒径达到纳米级的脂质体，包封率可达到80%以上[23]。

1.3.2 薄膜蒸发-喷雾干燥法

该法是先将脂质、包埋物等溶于有机溶剂，然后在梨形瓶内旋蒸蒸发去除有机溶剂得到薄膜状物质，再加入水或缓冲水溶液振动得到脂质体悬液，最后超声处理后经喷雾干燥制得脂质体前体。

1.3.3 流化床法

该法是将脂质有机溶液，用流化床转动切喷的方式喷于多孔载体粉末上，然后干燥一段时间，取出筛分即得固体粉末状脂质体前体。所用载体与载体沉积法中载体材料类似。Lei Guofeng等[24]以山梨醇为载体，用流化床法制得了颗粒流动性好、粒径分布较均匀(98nm)的灯盏花素脂质体前体，包封率为(63.1±2.8)%，并考察了载体、药脂比、进口温度、喷雾速率和喷雾风量对脂质体前体制备的影响，证明了流化床法制备灯盏花素脂质体前体是可行的。

在将脂质体进行喷雾干燥处理时，会有短暂的高温过程，这一过程产生的热效应可能会对脂质体的双层膜结构造成破坏，从而影响脂质体的完整性和包封率。另外，尽管脂质的存在可以在一定程度上对包埋物形成保护，但对于一些热敏性强的药物或食品营养素，也有可能受热发生不利变化。因此，在采用喷雾干燥法制备脂质体前体时，有时需要额外加入一些热保护剂来克服喷雾热效应。热保护剂通常是具有亲水性的聚合物，如甘露醇、蔗糖等，在脂质膜中其稳定作用的水分子气化脱离时，可与脂质的极性基团相互作用，从而起到稳定膜结构的作用[25]。也有研究认为，由于喷雾干燥过程中高温状态持续时间很短，且大部分热量均被水的相变过程吸收，故脂质与包埋物几乎不会受到影响；而所加入的亲水性物质更主要的是作为赋形剂起作用，以保证形成分散性好、粒径均匀的球形微粒[26]。

1.4 乙醇浓缩法

乙醇浓缩法被用来制备非固态脂质体前体，目前已经得到了广泛的应用，具体过程[7]是：将脂质、包埋物等通过加热、振荡等手段溶解于最少量乙醇中，形成澄清溶液，即得液态或半固态脂质体前体。乙醇也可使用其他与水相容的有机溶剂如丙二醇[27]、乳酸乙酯[28]等代替。由于乙醇浓缩法操作简便，以及非固态脂质体前体在贮藏稳定性方面也表现较好，这一方法受到了很多学者的青睐。Jukanti等[9]采用该法制备了依西美坦脂质体前体，与脂质体相比，大大提高了贮藏稳定性，在4℃条件下贮藏30d后，脂质体前体的形貌及水合后形成脂质体的尺寸、包封率及药物缓释都没有发生明显变化，形成脂质体为440～700nm的多层囊泡结构。目前已经有一些空白非固态脂质体前体作为商品在市场上出现，如Pro-lipo 3080 S、Prolipo C、Prolipo S等。

1.5 超临界流体法

该法主要利用超临界二氧化碳技术，以天然粉末磷脂和氢化磷脂为壁材原料，采用超临界微囊制备技术制备出固态粉末状脂质体前体。超临界二氧化碳是一种绿色技术，整个制备过程是一步反应，工艺流程简单、溶剂残留量低，适用于工业化大规模生产。

Kunnastitchai等[29]以气溶胶萃取法(ASES)制备了咪康唑脂质体前体，但该前体水合后形成的脂质体有明显的团聚现象，尺寸为微米级。我们实验室采用超临界加强溶剂分散法(SEDS)分别制备了辅酶Q10[30]、VD3[31]及叶黄素[32]的脂质体前体，经过水合后都得到了较小粒径的脂质体，且具有令人满意的包封率。

1.6 各种方法的比较

从脂质体前体的形态方面看，乙醇浓缩法用于非固态脂质体前体的制备，在制备和使用方面具有简便易行的优点；但与固态脂质体前体相比，非固态脂质体前体在稳定性方面仍相对较差，且有机溶剂含量较高，在食品药品方面的应用上会受到限制。在固态脂质体前体的制备方法中，载体沉积法的步骤较为繁琐，这是由于该方法中有机溶剂的不易去除造成的；冷冻干燥法在选择合适的冻干保护剂的情况下，可得到性能良好的脂质体前体；喷雾干燥法需要选择有效的热保护剂，在热敏性物质的包埋上有所限制；超临界流体法过程简便，易于去除有机溶剂残留，同样可得到效果良好的脂质体前体，但目前研究较少。从工业生产的角度，载体沉积法和冷冻干燥法只适用于实验研究领域，不宜用于大规模生产；而超临界流体法工艺流程简单，可连续性操作，具有工业化生产的潜力。

2 脂质体前体的应用

脂质体前体在物理化学稳定性、给药过程中微粒的完整性、加强药物溶解性和生物利用度、促进药物胃肠吸收、促进药物膜渗透能力、药物动力学等方面巨大的潜力，使其在食品和药品包埋方面有着越来越多的应用。理论上，脂质体既可以将亲脂性物质包埋于双分层子内部的疏水空间，也可以将亲水性物质包埋于双分子层外、单层囊泡之内或多层囊泡磷脂层之间。脂质体这一特点使得脂质体前体可广泛地应用于水溶性、脂溶性以及双亲性蛋白质、酶类、维生素、抗生素、风味物质、营养物等的包埋、运输及缓释。下面主要综述脂质体前体在疏水性和水溶性活性物方面的应用。

2.1 疏水性物质

疏水性物质由于其在水中不溶或难溶，如直接进入人体消化道，不易被肠道直接吸收，从而造成生物利用率低的现象。而脂质体由于其双分子层结构与生物细胞膜的高度相似性，容易渗透进入细胞内，因此利用脂质体前体技术包埋运送疏水性物质，可以增加营养素或药物的生物利用度。

2.1.1 薏仁籽油脂质体前体的制备

Bai Chunqing等[23]采用乙醇注入-喷雾干燥法制备了薏仁籽油脂质体前体，水合后脂质体粒径为211.9nm。该实验于喷雾干燥前，在脂质体前体表面包覆了一层羧甲基壳聚糖(CMCS)，以克服喷雾热效应对脂质膜结构的破坏；同时添加了抗氧化剂来防止活性成分和磷脂被氧化。从包封率、缓释性等角度考察对比了包覆和不包覆CMCS的脂质体前体，结果表明在喷雾干燥时，未包覆CMCS的脂质体前体膜结构被严重破坏。另外，包覆CMCS也增加了脂质体前体的稳定性，4℃条件下贮存6个月后，薏仁籽油脂质体前体仍能保持松散、均匀、流动性良好的性状，且水合后粒径与最初相当，载药量流失率约为9.3%，而不包覆CMCS的脂质体前体相同条件下流失率为40%。研究认为，CMCS与内界面依靠氢键作用结合，可防止喷雾干燥时的热破坏、团聚并提高机械强度。

2.1.2 维生素及其衍生物(脂溶性)脂质体前体的制备

孙珊珊等[33]以山梨醇为载体，乙醇为溶剂，大豆卵磷脂、胆固醇为原料，用载体沉积法制备了包封率较高的全反式维甲酸脂质体前体。杨静文等[34]也采用乙醇注入-冷冻干燥法，以乳糖为冻干保护剂，制备了全反式维甲酸的脂质体前体，包封率为95.2%，粒径约为170nm，乙醇残留量为3.98%，并对释药性和稳定性进行了考察。陈建明等[35]选择甘露醇做冻干保护剂，用乙醇注入-冷冻干燥法制备了VA的脂质体前体，所得脂质体前体水合后呈单室脂质体，平均粒径为0.615μm，药物包封率为98.5%，在40℃贮存3个月后无明显变化。

本研究团队[33]采用超临界抗溶剂法，以氢化磷脂为脂质原料制备了VD3的脂质体前体。考察了温度、压力和成分组成等条件，所得脂质体前体可迅速水合形成脂质体，脂质体包封率达到98.5%，粒径约为1μm。此外还对该方法制得的脂质体前体水合形成脂质体的机理进行了阐述，认为脂质体前体在这一过程中先后经历了固态、液晶态，然后形成了双层膜结构，并通过自组装最终形成了脂质体。

2.1.3 牛血清蛋白脂质体前体的制备

Ishikawa等[36]以大豆和蛋黄卵磷脂为原料，用乙醇浓缩-离心法制备了牛血清蛋白的脂质体前体。与一般乙醇浓缩法不同，该实验在制得液态脂质体前体、水合形成脂质体后，又通过离心手段获得了脂质体前体胶囊。另外，还同时采用薄膜分散-离心的方法制备了脂质体前体胶囊。得到的脂质体前体包封率最多达41.9%，当添加一定量海藻糖后，包封率提高至61.5%。脂质体前体胶囊在pH5和pH7条件下稳定，但在pH3条件下易降解，牛血清蛋白大量泄漏。然而，当使用大豆卵磷脂中可溶于乙醇的部分为脂质原料时，脂质体前体在pH3条件下稳定性大大提高，37℃贮存2h后牛血清蛋白仍保留74.5%，且对类似于胃部的酸性(pH1.2)条件下也表现出高稳定性，但在胆汁盐存在的情况下会快速降解。这一结果显示出该脂质体前体胶囊可用于营养成分的肠道靶向输送。

2.1.4 辅酶Q10脂质体前体的制备

祝青哲等[37]采用乙醇注入-冷冻干燥法制备了辅酶Q10的脂质体前体，水合后所得脂质体平均粒径为508nm，包封率达75%。考察比较了蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖及山梨醇作为冻干保护剂的不同效果，最终优选了海藻糖，认为海藻糖作为非还原性二糖，可在无水条件下保护生物膜功能，使脂质体在完全脱水时保持完整形态。还利用红外光谱分析认为，海藻糖与磷脂P=O基团之间形成氢键作用，且保护剂作用机制与“水代替假说”相符合。

本研究团队[32]利用超临界抗溶剂法，也对辅酶Q10脂质体前体的制备进行了研究。以胆固醇和大豆卵磷脂为脂质原料，在8.0MPa、35℃的超临界条件下，所得脂质体前体水合后包封率为82.28%，平均粒径为50nm。

2.2 亲水性物质

亲水性营养素或药物由于其水溶性，易被胃部吸收，通常在以肠道为靶向的口服给药途径方面存在障碍。利用脂质体前体技术，可对亲水性物质起到有效的保护作用，从而增加营养素或药物的稳定性。

2.2.1 酶类(亲水性)脂质体前体的制备

Ishikawa等[38]以大豆卵磷脂为原料，用乙醇浓缩-离心的方法对2种酶类(半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)脂质体前体胶囊的制备进行了研究，在酶和大豆卵磷脂质量为1：10时，所得脂质体前体胶囊包封率达到最高，分别为57.3%和53.0%。前体胶囊在pH5条件下稳定，但在pH3时不稳定。当使用少量壳聚糖包覆时，脂质体前体胶囊在pH3时稳定性显著提升。

2.2.2 VE

Zhao Liping等[39]首先使用薄膜分散法制备了VE脂质体，然后在脂质体表面包覆聚乙二醇(PEG)，最后以海藻糖为冻干保护剂进行冷冻干燥，得到VE脂质体前体。所得脂质体前体水合后平均粒径为164.2nm，包封率为83.87%。实验认为，PEG与脂质间以氢键结合，提高了脂质体前体的稳定性。4℃条件下贮存15d后，VE保留率为89.81%。另外，VE的缓释性可通过pH值进行调节。

2.2.3 黄酮类

宋金春等[13]采用载体沉积法，以大豆卵磷脂和胆固醇为原料，山梨醇为载体，甲醇/乙醚为溶剂，加入VE作为抗氧化剂，制备了葛根素脂质体前体。所得脂质体前体水合后形成圆形或椭圆形脂质体，呈单室或多室，平均粒径为278nm，包封率约为43.5%，在磷酸盐缓冲液(PBS)中24h后葛根素释放量为72.2%。对不同载体进行了对比，发现山梨醇作载体得到的脂质体前体流动性好、易于水合；而甘露醇、氯化钠、β-环糊精有湿结现象。此外，还对影响包封率的因素进行了考察，认为按影响程度从大到小依次为：药物-脂质比＞胆固醇-脂质比＞温度。

2.2.4 鲑降钙素

Song等[40]分别使用山梨醇和卵磷脂为载体和脂质，加入牛磺胆酸钠(NaTDC)，用载体沉积法制备了鲑降钙素脂质体前体。在大鼠活体实验表面，适量NaTDC的加入，能够使鲑降钙素的生物利用度增加7.1倍。同时，加入NaTDC还可以使脂质体前体水合后粒径从56.2nm显著减小(23.2nm)，且包封率增大2.8倍(从19.9%增大到54.9%)。作者认为，生物利用率的增加一方面是由于胆汁盐可以增加膜的流动性；另一方面则是由于NaTDC和鲑降钙素可通过脂质体前体的形式运送到肠道吸收位点，并形成阳离子复合物与该位点发生作用。除上述物质外，关于叶黄素[34]、莪术油[41]、丹皮酚[42]、丹参酮[43]、肉苁蓉总苷[29]等的脂质体前体制备也有报道。

从现阶段的研究结果看，水溶性物质的包埋比脂溶性物质更加困难，通常难以达到高于80%的包封率，而在脂质体外层包覆一层其他物质(如PEG、壳聚糖等)，可能是一个很好的改进方法。

3 结 语

脂质体前体克服了脂质体的物理不稳定性，可以解决脂质体中包埋物的渗漏、粒子的团聚、磷脂的氧化水解等问题，为脂质体在提高食品活性物的生物利用度和应用提供了一个有效的途径。目前脂质体前体的制备方法已经有了很大的发展，脂质体前体在食品营养物方面的应用成为研究的热点之一，但目前大多仍然处于实验研究阶段。现有的研究工作主要集中在制备粒子的粒径、包封率、体外缓释以及工艺参数方面，而对脂质体前体形成脂质体的深层机理的研究尚不足。同时，关于脂质体前体生物利用度的体内实验多见于药物类，在食品应用方面的研究并不多见。另外，多数制备方法如载体沉积法、冷冻干燥法等虽然可制备效果较好的脂质体前体，但无法应用于工业化大规模生产，而超临界流体技术的应用有可能解决这一技术难题。

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