放线杆菌生产琥珀酸的研究进展

范兆乾,刘 颖,刘均洪

(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

放线杆菌生产琥珀酸的研究进展

范兆乾,刘 颖,刘均洪

(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

总结了利用放线杆菌生产琥珀酸时,提高琥珀酸产量的主要途径,并介绍了琥珀酸的回收方法。

琥珀酸;放线杆菌;提高产量;提纯

琥珀酸可用作合成许多工业重要化学物的前体,包括己二酸、1,4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、琥珀酸盐和丁内酯等。另外,越来越多的琥珀酸用于合成生物可降解聚合物,如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酰胺(Nylon○Rx,4)和各种绿色溶剂[1]。目前,大多数商业化的琥珀酸都是用石油原料化学合成的,成本很高,限制了其大规模应用。与以石油为基质化学合成琥珀酸相比,利用可再生资源发酵生产琥珀酸不仅成本低得多,对环境也更友好。

适合高效生产琥珀酸的有机体包括真菌和细菌。S.cerevisiae是真菌中产琥珀酸效果最好的,能在酒发酵的过程中产生高浓度的琥珀酸。研究者对许多利用不同碳源发酵产琥珀酸的细菌菌种进行了筛选和研究。反刍动物的瘤胃能预消化大分子糖类,其特殊的环境为厌氧及兼性厌氧菌提供了良好的繁殖代谢条件,许多共生微生物能够很好地产生琥珀酸,放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)就是其中的一种,对它的研究也较深入。A.succinogenes是巴斯德氏菌属,是从牛瘤胃中分离出的兼性厌氧菌,也是一种温和的嗜高渗菌,对高浓度的葡萄糖有很好的耐性,利于发酵。

作者在此对放线杆菌发酵生产琥珀酸时,提高琥珀酸产量的主要途径和琥珀酸的回收方法进行了总结。

1 提高琥珀酸产量的途径

1.1 代谢途径的研究

为提高琥珀酸的产量,有必要对放线杆菌发酵产琥珀酸的代谢途径进行研究。Mc Kinlay等[2]利用13C原子标记分析代谢中间产物的位置研究琥珀酸代谢途径,结果表明磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是代谢过程中一个重要的节点。PEP羧化作用是琥珀酸生成过程中一个重要的反应,并与CO2水平紧密相关。这是因为高浓度的CO2使得PEP更多地羧化成草酰乙酸,而不是转化成丙酮酸盐。实际操作中,提高CO2的浓度确实会提高琥珀酸的产量,另外提高还原剂(H2)浓度也会提高琥珀酸的产量。发酵过程中,产生1 mol的琥珀酸需要消耗2 mol的NADH,为维持氧化还原电位(ORP)的平衡,会同时产生乙酸和蚁酸等副产物,且不同的氧化还原电位产生不同的副产物。目前,关于ORP对琥珀酸产生的影响已经有不少研究,但ORP对微生物生理的影响机制仍不清楚。Li等[3]以A.succinogenes NJ113为目标,调整ORP水平,发现在-350 m V时,琥珀酸产量最大(1.28 mol· mol-1)、产率最高(1.18 g·L-1·h-1),并证明ORP同代谢物分配、酶活性和NADH/NAD+密切相关。

1.2 选择适宜的基质

为提高琥珀酸产量、降低生产成本,发酵基质的选择是必须考虑的因素。实验室所用的碳源都是比较纯的糖类,要实现工业规模生产必须选择价廉且来源丰富的可再生资源,如糖蜜、淀粉和各种纤维素资源。Wan等[4]首次以干酪乳清为基质,利用A.succinogenes 130Z生产琥珀酸。Du等[5]先用真菌对小麦面粉进行发酵,再将发酵后的复合物作为A.succinogenes的底物。Jiang等[6]先水解用过的啤酒酵母,再以水解液作为原料,此法原料价格较低,且利用率较高。

Borges等[7]利用甘蔗渣纤维素水解液,得到产量22.5 g·L-1的琥珀酸。董晋军等[8]利用甘蔗糖蜜,得到产量46.0 g·L-1的琥珀酸。我国是农业大国,纤维素资源特别丰富,若能将此资源应用于琥珀酸生产,将更利于实现工业化。我国科研工作者已经开始从事这方面的研究,Li等[9]筛选的突变菌种M.JSTP就可利用秸秆水解液进行发酵,所得到的琥珀酸产量达56.0 g·L-1。

1.3 抑制副产物产生

副产物是影响琥珀酸产量的重要因素,主要有乙酸、蚁酸、乳酸、丙酸和丙酮酸等副产酸。细菌产乙酸的主要途径是磷酸转乙酰基酶/乙酸激酶(PTAACK)途径,而氟乙酸(钠)是乙酸类似物,可经PTAACK途径被细菌不可逆地转化为氟代柠檬酸而导致细菌细胞的死亡。因此,筛选对氟乙酸具有抗性的突变株,就可得到PTA-ACK途径转弱、乙酸积累降低的细菌菌株[10],据此可判断其商业生产的可行性。美国密歇根生物技术协会(MBI)筛选出的A.succinogenes抗8 g·L-1氟乙酸的突变株,琥珀酸产量达110 g·L-1,是目前报道的最高产量[11]。A.succinogenes 130Z及其变种(FZ6、FZ9、FZ21、FZ45、FZ53)均对氟乙酸盐有一定的耐性,相对其它已经报道的琥珀酸生产菌种,它们能够产生更多的琥珀酸,并且对高浓度的琥珀酸有更好的耐受性,但仍会产生各种副产酸。

考虑到混合酸的分离和纯化成本,应通过优化代谢和发酵条件,尽量减少或彻底避免副产物的产生。如通过响应面分析法建立各因素与响应值之间的数学模型,较直观地考察不同因素之间的交互作用,从而减少实验次数,提高效率,是培养基优化的良好方法[12]。周彬等[13]利用响应面法优化了CCMCC1593的发酵培养条件,产量比优化前提高了37.5%。在获得大量数据后,可通过BP神经网络进行分析。李兴江等[14]通过神经网络分析发现,当CO2体积分数为62%、H2体积分数为5.4%、生物素微量浓度为7.8 mmol· L-1时,A.Succinogenes HF13发酵产琥珀酸最高产量为75.8 g·L-1。

1.4 基因系统的研究

仅仅依靠优化发酵条件,并不能得到足够高的琥珀酸产量,还需要了解琥珀酸代谢过程中,各种酶的作用和碳原子的分配机制,这就使破译A.succinogenes基因系统成为必要。目前,A.succinogenes的病原性仍在研究中。Mckinley等[15]首次利用生物技术详细分析了A.succinogenes的基因序列,并验证了巴斯德菌科致病基因。结果表明,A.succinogenes缺少完整的三羧酸循环和乙醛酸循环,并且PEP羧化酶是唯一的PEP羧化的相关酶,同时,A.succinogenes缺少致病性,使得其应用于工业生产成为可能。

1.5 消除产物抑制

产物抑制是影响琥珀酸产量的主要原因之一。Wee等[16]研究表明,在摇瓶中A.succinogenes能产生74 g·L-1的琥珀酸,其中突变株FZH53的琥珀酸产量达到106 g·L-1,而在重复批次生物被膜反应器中琥珀酸产量仅为40 g·L-1。Li等[17]利用Logistic和Monod数学模型分析了E.coli和A.succinogenes的产物抑制动力学,发现蚁酸、乙酸、乳酸和琥珀酸的抑制浓度分别为8.8～17.6 g·L-1、10～40 g·L-1、9～18 g·L-1和10～80 g·L-1,当琥珀酸浓度为40 g ·L-1时,会明显抑制A.succinogenes的生长和发酵。原因在于酸性产物积累会迅速改变发酵液的p H值,因此需向发酵液中添加碱来维持菌体生长环境的酸碱平衡。但若只用单一的中和剂来控制p H值,大量的金属离子会造成菌体的絮凝,不利于生产。Wang等[18]向A.succinogenes ATCC55618的发酵液中添加组合中和剂——5 mol·L-1NaOH和40 g·L-1Mg-CO3调节p H值至7.5,琥珀酸产量达59.2 g·L-1,比单独添加NaOH时提升了27.9%,并消除了细胞凝集。添加组合中和剂,也是提升琥珀酸产量的策略之一。

1.6 其它途径

研究者不断努力,寻求不同的途径以提高放线杆菌产琥珀酸的途径[19],尤其是利用代谢和基因工程工具,可控制目标产物的代谢途径,减小甚至消除副产品的抑制作用等。

2 琥珀酸的回收方法

微生物发酵法生产生物产品的典型流程是接种、发酵、产品回收、浓缩和纯化,其中下游分离纯化过程的成本占到总生产成本的60%[20],因此发展经济的提纯方式是降低成本的关键。而在琥珀酸的提纯过程中,其纯化浓缩方法都比较成熟,如吸附、离子交换和结晶,已经可以大规模应用于工业生产,因此,将其与副产品有效分离回收就十分关键,目前琥珀酸的回收方法有沉淀法(氨沉淀法或钙沉淀法)、膜处理法(如电渗法)和液液萃取法(如反应提取法)等。

2.1 沉淀法

Hermann等[21]采用钙沉淀法,通过向发酵液中添加二氢钙盐,中和发酵液的同时使琥珀酸形成琥珀酸钙而沉淀下来,然后过滤、硫酸酸化,再进行酸和碱的离子交换,最终将琥珀酸的纯度提高到94.2%。钙沉淀法有一定的纯化效果,但不能完全去除蛋白质。另外,由于大量消耗氢氧化钙、生石灰和硫酸,并生成大量商业价值不高的硫酸钙,提高了成本,因此钙沉淀法难以应用于工业生产。

Yedur等[22]采用氨沉淀法,先用氨水滴定发酵液生成琥珀酸二胺,超滤除去杂质,再用硫酸二氢铵处理或者在低p H值下用硫酸处理得到琥珀酸沉淀,最后用甲醇溶解、重结晶,琥珀酸纯度达93.3%。氨沉淀法纯化效果好,副产物硫酸铵可循环利用,降低了成本,但目前该法仅用于实验室,未能工业推广。

2.2 电渗法

电渗法广泛用于制药和食品工业废水处理,此方法是利用离子交换膜将离子化合物从非离子化合物中分离出来。放线杆菌发酵液中琥珀酸一般以琥珀酸盐的形式存在,其它物质,包括糖类、蛋白质类、氨基酸类,大多以非离子形式存在。商业用或特殊用途的琥珀酸是游离的琥珀酸,而不是盐。因此,又发展了水裂解电渗法,即将发酵液电渗后,再用水裂解电渗膜除去大多数阳离子,从而获得高纯度的琥珀酸。为除去剩余的杂质阳离子、阴离子和氨基酸离子,需要联合阳离子交换树脂和阴离子交换树脂,进行进一步的纯化。因此,尽管采用电渗法提纯后,琥珀酸的浓度从51. 5%提升到79.6%,并完全去除了蛋白质和盐,但电渗过程中会损失40%的琥珀酸,杂质乙酸的浓度也从13.2%增大到19.9%[23]。

2.3 反应提取法

反应提取法在常温和常压下进行,能耗低,被认为是一种有效而经济的纯化方式。反应提取法是基于提取剂胺与被萃取羧酸的可逆性反应,有机酸溶于水相,提取剂胺溶于非水溶有机相,在两相接触的液面,根据酸的p Ka值和实际p H值,胺选择性地与阴离子亲密反应,形成的胺-酸复合物溶于有机相,从而达到提取效果。该法所用胺多为叔胺,有机溶剂多为乙醇、二甲苯、庚烷、煤油、二氯甲苯或硝基苯。Song等[24]利用三辛胺、1-辛醇反应系统提取琥珀酸,再经真空过滤和结晶,提取率达99%。

Jun等[25]研究表明,要提高琥珀酸的提取率,必须控制p H值在4.2以下,因为此时大多数有机酸分子以未解离的形式存在,但杂质酸和无机酸阴离子又会对提取率产生影响。为此,Huh等[26]逆向考虑,先通过反应提取法除去杂质酸,再在低p H值条件下除去葡萄糖,最后蒸发结晶,琥珀酸的纯度和总产率分别为99.8%、71.3%。

反应提取法还包括后续的相处理过程,即通过机械装置混合离心而分离两相。配备简单液液离心器的完整反应提取法提取工艺,已在实验室达到一定的规模,但整套提取工艺仍未能实现工业化。

2.4 预分散溶剂萃取法(PDSE)

预分散溶剂萃取法是基于分散相胶状液体泡沫(CLAs)[27,28],这些微米级的颗粒表面为含表面活性剂的油相薄膜,内部为溶有胺萃取剂的有机相。工作时,含琥珀酸的水相从柱顶端流入,分散相则以相同速率从柱底端注入,进行混合,由于这些微小颗粒具有巨大的传质面积和很高的传质效率,在不同的温度、p H值和浓度下,目的酸通过液膜进入预分散萃取体系CLAs的油相。因此,此法只需很小的体积比就可达到很高的萃取率。预分散溶剂萃取法的提取能力与反应提取法相当,但是能耗更低、更经济。目前,预分散溶剂萃取法已经成功应用于实验室规模的发酵生产。

3 结语

A.succinogenes仅是琥珀酸生产菌中的一种,其相关研究虽然很多,但仍不透彻,还不能满足大规模的工业应用。理想的产琥珀酸工程菌,应达到高产量、高产率,且没有副产品。当然,这也需要优化发酵条件,包括最廉价的碳源、最佳的生物量和生长条件,同时需选择先进的提取纯化工艺,从而降低总成本。总之,考虑到可再生资源的价格、潜在市场规模、对环境的影响、菌种改善、发酵及纯化工艺的发展,未来的琥珀酸发酵产业前景光明。

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The Research Progress of Succinic Acid Production by Actinobacillus Succinogenes

FAN Zhao-qian,LIU Ying,LIU Jun-hong
(Chemical Engineering College,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

Succinic acid is an important chemical precursorl for food,chemical and pharmaceutical industry, and can be produced through biological process.Actinobacillus succinogenes is an important succinic acid production strain.This paper summarizes the major ways of increasing succinic acid production,and briefly introduces the recovery methods.

succinic acid;Actinobacillus succinogenes;increasing production;purification

TQ 921.7

A

1672-5425(2013)05-0001-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.05.001

国家杰出青年科学基金资助项目(12-1-3-45-nsh)

2012-12-27

范兆乾(1988-),男,山东潍坊人,硕士研究生,研究方向:药物化学,E-mail:fan.1988@yahoo.com.cn;通讯作者:刘均洪,教授,E-mail:liujh@public.qd.sd.cn。