肝素和硫酸乙酰肝素前体Heparosan的合成研究进展

夏亚穆，戴晓丽

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛266042）

糖胺聚糖（GAGs）是一类由重复的二糖单元组成的不分支的带负电荷的多糖，通过参与细胞粘附、趋化因子信号传导、生化级联、信号转导以及病原体识别等在细胞中起到关键作用。鉴于其生理功能，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物［1，2］。其中，肝素（Hep）和硫酸乙酰肝素（HS）是糖胺聚糖家族的重要成员，是一类由糖醛酸和D－葡糖胺二糖重复单元以1，4－位键连接形成的线性多糖，其结构复杂、生物活性多样［3－6］，研发肝素和硫酸乙酰肝素新药已成为近年来多糖药物研究的热点。

Heparosan，又称 N－Acetylheparosan，［β－D－1，4－GlcA－α－D－GlcNAc］n（其中：GlcA 代表葡糖醛酸、Glc－NAc代表N－乙酰氨基葡糖），是肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体，也是它们合成过程中最重要的模板［7］。作者在此介绍了肝素／硫酸乙酰肝素的合成方法，综述了Heparosan的合成研究进展，并对生物工程领域合成Heparosan的前景进行了展望。

1 肝素／硫酸乙酰肝素的合成方法

1．1 肝素／硫酸乙酰肝素的传统合成

传统的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法有：动物衍生品的活性物质的复原、化学合成法和酶合成法。大多数商业化抗凝血剂肝素产品都是从猪肠粘膜中提取得到的［8］，而酶合成法和化学合成法结合的化学酶法可用于生产特定的肝素／硫酸乙酰肝素。

传统的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法都有一定的缺点。使用动物衍生品的生产方式并不能得到同质和明确的产品，并且有潜在的安全风险［9］。肝素低聚物的化学合成很困难，在经济上不可行。近年来发展的模块式合成和“一锅法”反应使得肝素类寡糖的化学合成取得了长足进展，但目前的策略仍然是特定序列导向的定向合成。化学酶法为肝素／硫酸乙酰肝素的合成提供了一条新的途径，使得深入的构效关系（SAR）研究成为可能。然而，化学酶法要用于肝素／硫酸乙酰肝素的大量合成还需要解决酶的来源以及糖基给体的大量合成［3］。因此，为了确保肝素／硫酸乙酰肝素的生产符合成本效益并保证安全，以及合成明确的基于肝素／硫酸乙酰肝素的药物，需要开发能精密控制合成步骤的新的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法，如生物合成法等。

1．2 肝素／硫酸乙酰肝素的生物合成

肝素／硫酸乙酰肝素的生物合成是在高尔基体内通过复杂的多酶体系实现的。首先，一个木糖（Xyl）残基、两个半乳糖（Gal）残基和一个葡糖醛酸（GlcA）残基逐步连接到核心蛋白的特殊丝氨酸残基上［10］，从而形成连接子四糖β－GlcA－（1，3）－β－Gal－（1，3）－β－Gal－（1，4）－β－Xyl，它是合成 Heparosan的模板［11］。1，4－位键连接的GlcNAc和GlcA单糖单元交替连接到连接子四糖上构成肝素多糖链，从而形成Heparosan，然后在一系列酶的加工下将其转化为肝素／硫酸乙酰肝素：N－去乙酰化酶／N－磺酸基转移酶（NDST），可以将GlcNAc单元上的N－乙酰基脱除并对裸露出来的氨基进行硫酸化修饰；C－5－位差向异构酶（C－5－Epi）通过对GlcUA的C－5－位构型翻转将其转化为L－艾杜糖醛酸（L－IdoA）；2－位O－磺酸基转移酶（2－OST）对IdoA 的C－2－位羟基进行硫酸化；3－位和6－位O－磺酸基转移酶（3－OST和6－OST）催化葡萄糖胺单元的 C－3－位和 C－6－位羟基引入磺酸基［3］。肝素和硫酸乙酰肝素的合成的差异发生在最后一步：已修饰的肝素蛋白聚糖的多糖链经内切β－D－葡糖醛酸糖苷酶在一些GlcA残基处裂解以得到更短的游离肝素链；内切硫酸酯酶通过减少O－硫酸化基团的数目，参与硫酸乙酰肝素的硫酸化模式［12，13］。

2 Heparosan的合成研究进展

2．1 从微生物中提取Heparosan

迄今为止，Heparosan聚合物被发现存在于致病菌大肠杆菌 K5（E．coli K5）、D型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida Type D）和副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum）的荚膜中。但是只有大肠杆菌K5被报道已用于微生物发酵生产Heparosan。研究显示，发酵产物Heparosan的分子量受到培养基组成和培养条件的影响，大规模发酵能够得到15g·L－1的发酵得率。Manzoni等［14，15］发现大肠杆菌 K5发酵后，由于培养基中出现裂解酶，Heparosan分子量分别为16kDa和1．5kDa。Wang等［16］报道了较高分子量的 Heparosan（50～80kDa）。

现阶段用于化学酶法合成肝素／硫酸乙酰肝素的Heparosan模板都是从大肠杆菌K5荚膜中得到后被降解到目标长度。Heparosan的降解分离是通过从肝素黄杆菌中得到的肝素酶来完成，这种方法会产生不饱和寡糖，这些不饱和糖醛酸残基的双键可利用汞盐或臭氧分解除去。据报道，一种二氧化钛催化光化学反应被用于控制Heparosan的解聚反应，不会产生不饱和寡糖。这种方法虽有一定的应用前景，但仍需进一步研究才能用于药用肝素／硫酸乙酰肝素的生产。尽管利用微生物生产Heparosan符合成本效益，对发酵产物Heparosan的解聚反应也已有研究，但仍不能严格控制和调节Heparosan的链长度和糖残基组成。由于Heparosan链上的GlcA和GlcNAc只有在聚合链合成之后才能被修饰，而控制聚合后修饰比较困难，通过在Heparosan链延伸过程中添加类似的糖来更精确地控制链结构成为研究的重点，比如以IdoA代替GlcA。

2．2 利用重组酶合成Heparosan

在哺乳动物细胞和微生物中，Heparosan通过糖基转移酶来合成，这种酶以尿苷二磷酸－糖（UDP－糖）为供体，交替地催化GlcNAc和GlcA残基转移到不断延伸的聚合物链上。

2．2．1 来自哺乳动物和果蝇的重组Heparosan合酶

哺乳动物的糖基转移酶EXT1和EXT2能够催化Heparosan链的延伸，EXT1和EXT2共同形成一个活泼杂络物，它们在重组细胞中的同时表达可以达到最强的催化活性。EXT1／2络合体与单独的EXT1一样通过添加一些额外的糖单元（10～20个糖单元），使大肠杆菌K5的Heparosan受体延伸。与EXT1不同的是，在没有EXT1、单独培养EXT2时并不能观察到显著的转移酶活性。Kim等［17］研究发现，以GlcAGal－O－C2H4NH－苄氧羰基作为模板时，纯化的EXT1／2络合体能合成约170kDa的Heparosan聚合体。如果以磷脂酰肌醇蛋白聚糖－I核心蛋白或α－血栓调节蛋白聚糖作为模板则能合成约200kDa的Heparosan聚合体。目前未见关于哺乳动物糖基转移酶的活性和聚合物链长度延伸调节的详细分析。在果蝇中，一类与哺乳动物EXT同源的蛋白TTV、SOTV和BOTV参与合成Heparosan。

2．2．2 来自大肠杆菌K5的重组Heparosan合酶

在大肠杆菌K5中，Heparosan的合成主要受葡糖胺基转移酶（KfiA）和葡糖醛酸基转移酶（KfiC）的调节，它们在Heparosan的非还原末端进行活化的单糖单元的转移和链的延伸。Sugiura等［18］在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出KfiC和KfiA，并发现在酶作用底物和模板分子的存在下，当只有KfiC时并未表现出转移酶活性，而只有KfiA时表现出了GlcNAc转移酶活性；此外，过量KfiA的存在能提高聚合活性，而过量KfiC的存在对聚合活性没有影响；在Heparosan寡糖模板（七聚体）存在下，分别培养KfiA／KfiC络合体8h或18h能合成约10kDa和20kDa的Heparosan链。Liu等［19］发现KfiA和PmHS2的结合可用于控制Heparosan低聚糖的延伸。

2．2．3 来自D型多杀性巴氏杆菌的重组Heparosan合酶

Heparosan在D型多杀性巴氏杆菌中的合成有别于大肠杆菌K5，它受到一个双功能糖基转移酶Pm－HS1的控制。之后PmHS1同源物PmHS2也被鉴定出来。它们虽然有很高的氨基酸水平的同源性（73%），但重组PmHS1和PmHS2表现出不同的聚合特性。Sismey－Ragatz等［20］研究在模板缺少或存在条件下多杀性巴氏杆菌GAG合酶的聚合作用时发现了GAG合酶PmHS1（Heparosan合酶）和PmHAS（透明质酸合酶）之间的相似性：它们都表现出对短的低聚糖受体位点比对UDP－糖更高的亲和性。在反应混合物中加入低聚糖模板能避免聚合物链的引发，有利于合成更窄的长度分布的链。通过控制PmHAS和UDP－糖／透明质酸模板的量，可以得到分子量明确（16～2000kDa）、分布较窄的多分散性聚合物。因此，在与PmHAS相似的条件下，PmHS1也可能控制Heparosan的延伸。然而，Chavaroche等［21］发现与PmHS1和PmHAS相比，PmHS2并未表现出同样的亲和性。聚合物链的引发受控于聚合反应中的UDPGlcNAc亲和性，当Heparosan模板在过量的UDPGlcA存在下培养时能得到更窄的长度分布。

除了利用PmHS，通过多杀性巴氏杆菌糖基转移酶控制Heparosan延伸的方法也可由另一途径实现。Coutinho等［22］发现以天冬酰胺（N）替代位于催化中心的DXD氨基酸基序中的2个天冬氨酸（D）会导致催化结构域的失活。PmHS1和PmHS2单动转移酶突变体已在DXD序列上通过相应的定向诱变得到［21，23］。当PmHS1和PmHS2的葡萄糖醛酸转移酶（PmHS－GlcA＋）和乙酰氨基葡糖转移酶（PmHS－Glc－NAc＋）一起培养时，能够通过转移一个GlcA和一个GlcNAc残基来延伸Heparosan。在没有低聚糖模板时，PmHS2能引发和延伸 Heparosan链，并且只有PmHS2－GlcA＋能够引发 Heparosan合成［21］。此外，PmHS2通过转移修饰后的糖表现出聚合特性。Pm－HS2单动转移酶已被逐步用于Heparosan低聚糖的合成，值得注意的是 PmHS2－GlcA＋和 PmHS2－Glc－NAc＋并不需要形成络合体来表现催化活性［24］。Sismey－Ragatz等［20］报 道 在 二 糖 受 体 （GlcA－AnMannose）存在下，KfiA和PmHS2实现了Heparosan的逐步延伸。但是由于PmHS2的双重作用，须谨慎控制合成过程。总之，多杀性巴氏杆菌Heparosan合酶在已知的Heparosan合酶中是个特例。由双功能单动转移酶组成的PmHS2能从UDP－糖类似物延伸，有利于控制Heparosan的合成，从而产生有新的生物特性的肝素／硫酸乙酰肝素。

2．3 利用转基因细菌合成Heparosan

目前还没有利用转基因细菌合成Heparosan的报道，但转基因细菌生产透明质酸已经成功实现。透明质酸由和Heparosan一样的糖单元、不同的糖苷连接（β－D－1，3－GlcNAc－β－D－1，4－GlcA）n组成。类马链球菌透明质酸合酶hasA基因和UDP－葡萄糖脱氢酶基因在枯草杆菌中的表达能够得到g·L－1级别的透明质酸（1．1～1．2MDa）［25］，产率与透明质酸的天然生产菌类马链球菌菌株（7g·L－1）相近［26］。此外，源自多杀性巴氏杆菌的透明质酸合酶也在大肠杆菌中被表达出来，并成功生产透明质酸。这一发现有望应用于重组大肠杆菌产 Heparosan［27］。

3 结语

控制Heparosan的合成是生产肝素／硫酸乙酰肝素的关键步骤。Heparosan合成方法各有利弊。尽管从细菌荚膜中分离Heparosan具有一定的经济效益，但大肠杆菌K5是一个人类病原菌，当其用于药用化合物的生产时，需经过多轮随机突变以减少毒性［26］。此外，细菌荚膜生产Heparosan并不能控制链的延伸和二糖单元组成［28］。由于非致病性微生物的可用性，调节Heparosan合酶的表达能够部分控制聚合物的合成，然而，现有的技术水平还不能控制聚合物链的长度。由于多杀性巴氏杆菌Heparosan合酶PmHS2的双功能单动转移酶活性，其在没有模板存在下引发Heparosan链的能力以及可从UDP－糖延伸的特点，PmHS2被看作是剪裁肝素／硫酸乙酰肝素链最适合的生物催化剂。可以认为，尽管需要UDP－糖再生方法，相对于控制聚合物分子量［21］和改性UDP－糖的整合［20］来合成特定的Heparosan聚合体，使用体外生物催化剂的合成方法是最有前途的。此外，利用转基因细菌合成Heparosen的应用潜力较大。

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