ABA及其合成抑制剂对喜树幼苗喜树碱及抗氧化酶的影响

武应霞，毕会涛，李继东，胡春瑞，冯建灿

（1.河南农业大学，河南 郑州 450002；2.河南职业技术学院，河南 郑州 450046）

喜树Camptotheca accuminata是我国原产树种，因能生产具有抗肿瘤活性的喜树碱而受到关注。喜树碱是次生代谢的产物，已完成的研究发现，正常条件下喜树碱在喜树中的含量很低，在水分胁迫条件下喜树幼苗叶片的喜树碱含量明显升高[1]，同时其它环境因子对喜树幼苗中喜树碱含量的影响也得到了关注，如水渍和遮荫[2]、光强[3]、增施氮磷钾复合肥[4-5]。激素类物质在调节植物初生长和发育的同时，对植物的次生代谢也有着重要的影响。如在黑莨菪转化根培养中NAA对根的生长没有影响，但是与没有添加生长素的对照相比，生物碱的积累提高了1倍，即外源生长素不影响生长，但是可以增加生物碱的含量[6]。相反，在长春花的细胞悬浮培养中，去除2,4-D则可以增加喜树碱的含量[7]。BA和水杨酸可以增加水培条件下喜树中喜树碱的含量，但由于生物量的降低，并没有提高喜树碱的总产量；NAA对喜树碱的含量没有影响，但是能降低喜树碱的产量[8-9]。而茉莉酸甲酯和乙烯利也能在一定程度上增强喜树碱的合成，而且因为诱导子含量不同而表现出一定的差异[10]。然而关于ABA对喜树碱积累的影响的研究尚未见报道。

在对喜树在水分胁迫下内源ABA含量和喜树碱含量的变化的研究中[11]，发现在胁迫下二者均随着胁迫强度的增大和时间的延长而增高。然而，在水分胁迫下喜树中ABA与喜树碱含量变化之间是否存在某种关联尚未可知。如果二者存在一定的联系，那么就可以利用ABA来诱导和促进喜树碱的合成，从而得到满足需要的喜树碱提取材料。

因此，本试验中利用高分子渗透调节剂聚乙二醇（polyethylene，PEG）模拟干旱胁迫处理喜树幼苗，使用ABA和ABA合成抑制剂氟啶酮（Fluridone）预处理喜树幼苗，研究在此条件下喜树幼苗内ABA含量、喜树碱含量及抗氧化酶活性的变化，以探讨ABA在喜树碱生物合成中所起的作用，以及ABA对抗氧化酶的诱导作用，旨在为喜树碱的化学调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验采用4周龄喜树实生幼苗为试验材料。

喜树种子采于河南省桐柏县。挑选饱满种子，用0.1%HgCl2消毒20 min，冷水浸种24 h，后与湿沙1∶1混合催芽，15 d后将种子与沙分离，把种子放在1个带盖容器内再催芽。再过10 d，选取健壮幼苗定植到16 cm×22 cm塑料周转箱内，用泡沫板和脱脂棉固定，加入100 mL 1/2Hoagland营养液，每2 d换1次营养液。放入LRH-250-GSⅡ微电脑控制人工气候箱中培养，光照时间为8:00～22:00，湿度70%，温度25 ℃，每天早晚各通气10 min。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验中共设置4个处理：

（1）1/2 Hoagland营养液培养（CK）；

（2）1/2 Hoagland营养液中加入15% PEG 6000 处理（PEG）；

（3）1/2 Hoagland营养液中加入15%PEG 6000处理＋10 µmol·L-1ABA处理（PEG＋ABA）；

（4）10 mmol·L-1氟啶酮营养液预处理24 h后再以15%PEG6000处理（PEG＋氟啶酮）。

每个处理重复3次。在处理开始0、12、24、36、48、60 h时分别取幼苗全株，分别用于超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性的分析。在60 h时取幼苗全株5 g左右用于喜树碱（CPT）含量测定。在处理开始0、24、36、60 h时取幼苗全株1 g左右用于脱落酸（ABA）含量测定。

1.2.2 指标测定

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用 NBT光照化学还原法[12]；过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈伤木酚氧化法[13]；过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法测定[13]；喜树碱含量的测定采用高效液相色谱法（HPLC法）；脱落酸（ABA）含量的测定采用酶联免疫法（ELISA法）。

1.3 数据分析

所有数据使用SPSS软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 对喜树幼苗过氧化物酶（POD）活性的影响

POD 在植物体内具有广泛的作用，其主要作用之一是催化H2O2降解。各处理中喜树幼苗内POD活性均呈现先上升后下降的趋势（见图1）。在PEG处理中，POD活性在12 h时达到最大值106.8 U·g-1min-1，较同期对照值高61.08%，在60 h时下降到77.5 U·g-1min-1，较对照高21.85%。在PEG+ABA处理中，POD活性在12 h时达到最大值117.7 U·g-1min-1，较对照高77.53%，较PEG处理下最大值高10.21%，在60 h时下降到90.0 U·g-1min-1，较对照高41.51%。在PEG+氟啶酮处理中，POD活性在24 h时达到最大值87.3 U·g-1min-1，较对照高37.48%，较PEG处理下最大值低22.34%，到60 h时下降到72.4 U·g-1min-1，较对照高13.84%。外源ABA可以提高POD活性[14]，而ABA抑制剂使POD活性降低。

图1 渗透胁迫对喜树幼苗过氧化物酶(POD)活性的影响Fig.1 Effect of osmotic stress on POD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.2 对喜树幼苗超氧化物歧化酶活性（SOD）的影响

SOD的主要功能是清除氧自由基，是防止其对细胞膜系统伤害的一种很重要的抗氧化酶。各处理导致喜树幼苗内SOD活性下降（见图2）。在PEG处理中，SOD活性在12 h时已经下降到32.7 U·mg-1，比对照低35.78%，随后下降速度减缓，至60 h时SOD活性小幅上升，为29.8 U·mg-1，仍比对照低52.01%。在PEG＋ABA处理中，SOD活性呈下降趋势，但下降幅度比PEG处理小，60 h时，SOD活性值为31.7 U·mg-1，较对照低42.90%，较PEG处理值高6.38%。在PEG＋氟啶酮处理中，SOD活性缓慢下降，12 h时比对照低14.41%，较PEG处理高16.21%，60 h时SOD活性略有上升。在渗透胁迫下，喜树幼苗SOD活性不断下降，在ABA被抑制后，喜树幼苗内SOD活性高于单纯渗透胁迫下的水平，这说明ABA抑制剂的使用降低了SOD活性[15]，说明ABA与植物抗氧化酶活性有直接关系。

图2 渗透胁迫对喜树幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响Fig.2 Effect of osmotic stress on SOD activity in Camptotheca acuminata seedlings

2.3 对喜树幼苗内过氧化氢酶(CAT)活性的影响

CAT可把H2O2分解为H2O和O2，以清除H2O2的毒害作用。现在普遍认为植物受到环境胁迫后，保护酶活性下降。

图3 渗透胁迫对喜树幼苗内过氧化氢酶（CAT）活性的影响Fig.3 Effect of osmotic stress on CAT activity in Camptotheca acuminata seedlings

各处理中喜树幼苗内CAT活性均降低（见图3）。在PEG处理中，60 h时CAT降到最小值2.512 mg·g-1min-1，比对照低38.41%；在PEG＋ABA处理中，CAT活性在60 h时达到最小值2.645 mg·g-1min-1，较对照低31.46%，较PEG处理下最小值高5.29%；在PEG+氟啶酮处理中，CAT最小值2.953 mg·g-1min-1，比对照低17.74%，比PEG高17.56%。CAT活性在渗透胁迫下一直下降，ABA抑制剂可以抑制CAT活性下降。

2.4 对喜树幼苗内脱落酸（ABA）含量的影响

逆境条件可刺激ABA合成，尤其是干旱胁迫时更为显著[16]。渗透胁迫下各处理ABA含量均高于对照（见图4）。PEG处理使喜树幼苗内ABA含量大幅度上升，在12 h时，达到最大值1 832 ng·g-1，比对照高144.84%；在PEG＋ABA处理中，ABA的含量在12 h已经上升到1 940 ng·g-1，在36 h时达到最大值2 319 ng·g-1，是对照的233.67%，比PEG处理同期高75.42%。在PEG+氟啶酮处理中，ABA的含量在12 h最高，比对照最大值高52.45%，较PEG处理的最大值低63.28%，较PEG+ABA处理最大值低106.68%。

2.5 对喜树幼苗内喜树碱（CPT）含量的影响

各处理的喜树碱含量变化不同（见图5）。PEG处理的喜树幼苗内喜树碱含量为0.120 9%，比对照高6.61%；在PEG＋ABA处理中，喜树碱含量为0.114 4 %，略高于对照，但低于PEG处理；在PEG＋氟啶酮处理中，低于其它各处理，ABA抑制剂降低了喜树碱的含量，这说明ABA对喜树碱的合成存在一定的诱导作用。

图4 渗透胁迫对喜树幼苗内脱落酸含量的影响Fig.4 Effect of osmotic stress on ABA content in Camptotheca acuminata seedlings

图5 渗透胁迫对喜树幼苗内喜树碱含量的影响Fig.5 Effect of osmotic stress on CPT content in Camptotheca acuminata seedlings

3 结论与讨论

渗透胁迫下喜树幼苗的各项抗氧化酶变化趋势与其它植物相似[17-19]，渗透胁迫提高了保护性酶SOD、POD和CAT的活性，提高其抗旱性。

外源ABA及其合成抑制剂对渗透胁迫下喜树幼苗的各项指标有较大的影响。渗透胁迫下施用外源ABA致使喜树幼苗内ABA含量剧烈上升，减少了渗透调节物质的积累，减弱了渗透胁迫导致的抗氧化酶类活性的变化，减轻了渗透胁迫的作用效果。使用抑制剂氟啶酮抑制渗透胁迫下喜树幼苗内ABA生物合成后，可以降低抗氧化酶类活性的剧烈变化、减少内源ABA的积累、减少喜树碱因为渗透胁迫引起的积累。因此，ABA可以调控喜树幼苗内渗透调节物质的积累和抗氧化酶类活性变化，可以诱导喜树碱的生物合成。但是，ABA对喜树碱的生物合成具有促进作用的含量阈值范围以及ABA对喜树碱生物合成过程中关键酶的影响还需要进一步的研究。

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