纳米基因载体研究进展

卢艳敏

（1.衡水学院生命科学系，衡水 053000；2.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）

纳米（nm）是一种长度单位，1 nm=10-9m。纳米颗粒是指尺寸在0.1 nm-100 nm的超微粒子，由它们作为基本单元组成的材料称为纳米材料。纳米技术（nanotechnology）概念起源于物理学家R.Feynman，是研究纳米材料性质和应用的技术，它直接操纵单个原子、分子，用单个原子、分子制造物质，并研究其运动规律及特性的技术［1，2］。纳米生物技术是在纳米水平上研究生命现象的技术，它是纳米技术和生物学相结合的产物，研究内容包括：利用新兴的纳米技术来研究和解决生物学问题，利用生物大分子制造分子器件、模仿和制造类似生物大分子的分子机器。细胞的尺寸为微米量级，生物大分子的尺寸为纳米量级，纳米微粒的尺寸一般比生物体内的细胞小得多，这为生物学研究提供了一个新的途径［3］。目前，纳米技术是生物技术领域的研究热点之一，主要应用于药物的定向运输与可控释放［4-6］，细胞与核酸、蛋白质等生物大分子的富集和分离［7］，单个活体细胞的实时监测［8-11］，作为基因载体用于基因治疗等［12，13］。

1 纳米材料的性质

1.1 表面效应

表面效应是指随着颗粒粒径的变小其比表面积急剧增大，从而使纳米颗粒的表面原子数与总原子数之比显著增大，导致表面原子的配位数不足，有许多悬空键，具有不饱和性和高的表面能，使纳米颗粒表面原子变得极其不稳定，易于与其他原子相结合而稳定下来，因此纳米粒子表现出很高的化学活性［14］。

1.2 小尺寸效应

小尺寸效应是指当颗粒的尺寸与光波的波长、电子的德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，纳米粒子表面原子密度减少，导致颗粒宏观物理性质发生变化，呈现特殊的光学性质、热学性质、磁学性质、力学性质及电学性质。

1.3 宏观量子隧道效应

当微观粒子的总能量小于势垒高度时，该粒子仍能穿越这一势垒。微观粒子具有的这种贯穿势垒的能力称为隧道效应。近年来，人们发现纳米粒子的一些宏观量，如纳米颗粒的磁化强度，量子相干器件中的磁通量及电荷等也有隧道效应，它们可以穿越宏观系统的势垒而发生变化，因此称为宏观的量子隧道效应［15］。

1.4 量子尺寸效应

量子尺寸效应是指当颗粒尺寸下降到某一值时，费米能级附近的电子能级由准连续能级变为离散能级的现象［16］。当热能、磁能、静磁能、静电能、光子能量或超导态的凝聚能比能级间距还小时，会导致纳米颗粒的磁、光、声、热、电，以及超导电性与宏观物质截然不同［17］，如导电的金属在颗粒尺寸下降到某一值时会变成绝缘体。

2 纳米基因载体的特点

理想的基因载体要具有高安全性和低免疫原性，能够保护DNA不被核酸酶降解，可以运载不同大小的基因片段。选用高效、安全的基因载体是基因治疗的一个关键问题，病毒载体是基因治疗中较为常用的DNA运载工具［18］，其运载效率高，但该系统具有免疫原性和病毒性，装载容量有限等缺点，限制了病毒载体的广泛使用［19］。非病毒载体主要包括脂质体［20］，阳离子多聚体［21-25］和纳米颗粒［26］，它们具有高的安全性、良好的生物相容性、易于生产、可以运载不同大小的DNA片段，保护DNA免受核酸酶的降解作用等优点［27-29］。因此，非病毒载体的研究日益受到人们的重视。随着纳米技术的兴起，纳米颗粒作为非病毒载体在基因治疗上的应用成为研究热点。

纳米颗粒能与DNA结合形成复合物，纳米载体与DNA分子的偶联可以通过静电吸附，也可以通过化学键结合。这种结合能够有效地保护与纳米颗粒结合的外源DNA，使之免受各种酶的消化，提高了转染效率。纳米颗粒在生物体及细胞内外具有高的稳定性，不易被降解［30］，且因其亚细胞的尺寸效应容易被细胞吞噬，通过细胞的吞噬作用可携带核酸进入细胞，纳米颗粒进入细胞后可以快速地从溶酶体中逃逸出来进入细胞质。纳米颗粒可介导DNA在细胞核染色体基因组上整合，获得外源基因的稳定表达。

3 纳米基因载体的转运机制

理想的纳米载体基因复合物是带有大量正电荷，这样更容易通过静电作用吸附到带负电的细胞膜，从而引发细胞的内吞作用。纳米载体基因复合物进入细胞到发挥作用需要克服一系列屏障［26，31，32］。首先，纳米载体基因复合物与细胞膜等形成内含体，溶酶体迅速将内含体吞噬，在溶酶体内如果纳米颗粒不能有效地保护基因，并且基因不能及时有效地被释放，则会被溶酶体酶降解，外源基因能否及时有效地从溶酶体中逃逸是影响转染效率的关键步骤。当发生内吞作用后，内含体膜上的ATP酶激活，利用ATP水解的能量将胞质中H+泵入，从而降低了内含体内的pH，使溶酶体酶发挥分解作用。如果纳米载体表面含有能在生理pH条件下发生质子化的氮原子（如PEI中的N），它就会结合累积的质子从而抑制内含体pH的降低。质子不断泵入内含体内，并伴随着氯离子的被动流入使得内含体内的pH不断升高，这不仅可以抑制溶酶体内酶对外源DNA的降解作用，同时可引起内含体肿胀、崩解，从而释放出纳米载体基因复合物。纳米载体基因复合物进入细胞后，为尽快地让基因从溶酶体内逃逸，也可以使用溶酶体释放剂，如氯喹、聚乙烯吡咯酮、蔗糖等［33］。当外源基因从内含体进入细胞质内，它是否不被胞质内酶降解，并顺利进入核内也影响着基因功能的发挥。基因进入核内有两个途径，一是细胞分裂时，核膜破裂；另一是经核孔进入，具体机制目前仍不清楚。

4 纳米基因载体研究进展

纳米基因载体通常是由生物兼容性材料制备而成的纳米微囊或纳米粒子，可以通过包裹或吸附外源DNA等核酸分子形成纳米载体基因复合物。纳米载体粒径通常在10-100 nm之间，其巨大的比表面积所产生的化学活性，使其具有很高的吸附、浓缩和保护DNA的能力，这是纳米基因载体对外源基因发挥吸附、运转功能的主要原因之一。纳米颗粒因其粒径小可以通过细胞内吞作用携带外源基因进入细胞，随后释放基因分子发挥功能［34］。纳米基因载体采用的材料分为有机材料和无机材料两类，有机材料主要是高分子聚合物，包括树枝状聚合物、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺和壳聚糖；无机材料主要包括二氧化硅、氧化铁和量子点等。

4.1 有机材料

4.1.1 PAMAM树枝状大分子（poly-amidoamine dendrimer） 树枝状大分子是一类球形、高度支化的高分子，这类分子结构复杂，从中心原子或中心环上辐射出很多分支。PAMAM（Poly-amidoamine）树枝状大分子是1985年由Tomalia等合成的，可通过表面所带的阳离子和DNA通过静电作用结合，可携带不同大小的DNA片段，所形成的体系稳定。另外，它具有很好的分散性，良好的生物相容性，较高的转染效率，较低的细胞毒性，可以转染多种原代细胞，其转染效率与代数及其支化程度密切相关［35，36］。PAMAM树状分子表面含有大量官能团易于进行修饰改性，从而进一步降低细胞毒性，提高转染效率［37，38］。Liu等［39］以三羟乙基胺为核合成了PAMAM树状大分子，该树状大分子能携带绿色荧光蛋白基因进入细胞和鼠的胸腺中进行表达。PAMAM可携带SiRNA进入癌细胞干扰靶基因的表达［40，41］。

4.1.2 多聚赖氨酸（poly-L-Lysine，PLL） 多聚赖氨酸是一种阳离子多肽，是较早用于转运基因的高分子聚合物纳米材料。目前，多聚赖氨酸作为非病毒基因载体得到广泛的应用［42］。多聚赖氨酸具有生物可降解性，有助于体内基因的转导。由于多聚赖氨酸/DNA复合物不能快速的从内含体中释放，导致转染效率较低，并且细胞毒性大，但它易于进行表面修饰，如连接亲水聚合物、配体及融膜多肽，从而降低毒性，提高转染效率。聚乙二醇（PEG）是一类亲水的、具有生物相容性的聚合物，具有较好的稳定性，以PEG制成纳米颗粒表面修饰PLL作为基因载体，可以降低细胞的毒性，很好的结合DNA，增加纳米颗粒/DNA复合物的水溶性，提高转染效率［43］。

4.1.3 聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI） PEI是应用最广泛和最有效的非病毒载体之一［44］，聚乙烯亚胺表面带有较高的正电荷，可以吸附DNA分子，浓缩DNA分子，保护DNA免受酶解，实现DNA分子的细胞内转运。由于PEI具有“质子海绵”效应，使得其介导的基因转染效率较高。聚乙烯亚胺可以结合泵入核内体的H+，具有很强的H+缓冲能力，避免溶酶体酶对DNA的降解作用，对DNA具有很好的保护作用，同时会伴随着Cl-的大量内流，造成核内体肿胀破裂，使基因快速进入细胞质，并进一步转移至细胞核内发挥作用［45，46］。由于PEI与病毒载体相比，具有相对低的转染效率，并且缺乏组织靶向性，限制了PEI的使用，尤其是体内基因的转运，因此目前的研究集中在提高基因转染效率和载体的靶向性［47］，可在PEI表面修饰抗体［48］、肽［49］、乳铁蛋白［50］、甘露糖醛酸［51］及叶酸［52］等配体。这些修饰既可以提高基因的转染效率，又可以增强转染复合物的靶向性，同时可以降低对其他组织细胞的副作用。

4.1.4 壳聚糖（chitosan，CS） 壳聚糖是一种天然高分子聚合物，由甲壳素经过部分脱乙酰作用形成的氨基多糖，具有很好的生物相容性，在体内可被降解，且分解产物对人体无害。作为基因载体进行细胞转染时，可以增强DNA的稳定性，有效地保护DNA免受酶的降解作用［53，54］。

4.2 无机材料

无机纳米材料稳定，分散性好，制备方便，粒径容易控制，装载量大，无免疫原性，细胞毒性小，易于在表面偶联特异性分子而实现靶向运输，提高转染效率。目前应用较多的有硅纳米颗粒［55］，氧化铁颗粒［56］，硫酸钙颗粒［57］和纳米金颗粒［58］等。

5 结语

为了提高纳米颗粒/DNA的转染效率，可以对纳米颗粒进行表面修饰以改善颗粒的表面结构和性能。DNA磷酸骨架在生理pH下带负电，可以与带正电的基因载体有效结合。因此，在纳米颗粒表面修饰携带阳性电荷的物质，如多聚赖氨酸、PEI，更有利于纳米颗粒/DNA复合物的形成。纳米颗粒作为基因载体进行基因治疗时的靶向性比较差，可在其表面偶联特异性的靶向分子，并通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，实现靶向运输［59］。

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