酶法制备人乳脂替代品的研究进展

张超越，辛嘉英,2,*，陈林林，王 艳

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000)

人乳是婴儿主要和首选的营养来源，是促进婴儿健康成长的黄金标准[1]。人乳脂肪(human milk fat)能提供婴儿生长所需膳食能量的40%～55%[2]，供给必需的营养物质，例如甘油三酯中的脂肪酸和长链多不饱和脂肪酸，并可作为脂溶性维生素的载体[3-4]，但由于现代生活模式、工作压力、个人因素等影响[5]，存在母乳不足、母乳营养缺乏、需要增加辅食等情况，婴儿配方奶粉成为可供选择的最佳食品之一。而婴儿配方奶粉中添加的牛乳脂肪在脂肪酸组成及分布上与人乳脂肪差异较大，不能更好地满足成长中婴儿的营养需求。因此，近年来对于具有天然油脂的物理特性且脂肪酸组成和结构与人乳脂相似的人乳脂替代品(human milk fat substitutes)的研究备受关注。本文综述人乳脂中甘油三酯的结构和组成的特异性，指出婴儿消化吸收的特点和近年来人乳脂替代品的研究进展，以及现阶段存在的问题，并对人乳脂替代品的研究前景进行展望。

1 人乳脂中甘油三酯的结构和组成的特异性

人乳脂中的脂肪酸组成与含量随地域、人种、饮食的不同差别很大，甚至1d内的不同时间，其乳汁中甘油三酯的脂肪酸组成也不一样[6]。油脂中的脂肪酸因其种类及分布位置不同而具有不同的物理化学性质和营养学意义，尤其是脂肪酸的位置分布决定着脂肪酸和营养物质的吸收代谢[7-8]，并决定了油脂的应用价值，即使含有等量的同种脂肪酸，但由于脂肪酸位置分布的差异，也将导致不同的吸收利用结果。故油脂中的脂肪酸组分固然重要，但脂肪酸的位置分布也不容忽视[9]。

人乳中脂肪含量为4.0%～4.5%，其中98%是甘油三酯。人乳脂与植物油和反刍动物乳相比，具有独特的结构特征，例如，含有大量长链脂肪酸，如棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸；脂肪酸组成中油酸含量最大；60%～70%的棕榈酸(C16∶0)位于Sn-2位上[10]，而5.7%～8%的硬脂酸(C18∶0)、30%～35%的油酸(C18∶1)和7%～14%的亚油酸(C18∶2)等不饱和酸，则优先在Sn-1,3位上等[11]。

2 乳脂消化吸收的特点

饮食中摄入的脂肪酸、甘油三酯(TAG)在人体内被脂肪酶消化吸收时，胰脂肪酶通常将甘油三酯水解成Sn-1,3位游离脂肪酸和Sn-2位甘油单酯。Sn-1,3位上的不饱和及短链游离脂肪酸容易被人体吸收，而饱和脂肪酸则不易被人体吸收[12]。

棕榈酸是人乳脂肪中主要的脂肪酸组分，并且绝大多数分布在甘油三酯的Sn-2位上，而牛乳和某些婴儿配方乳中的棕榈酸主要分布在Sn-1或Sn-3位上，进入机体后被胰脂肪酶水解为游离脂肪酸，易与食物中的钙离子形成钙皂排泄出来，造成钙和能量的流失，人体利用度较差[13]。而Sn-2位的棕榈酸单甘酯可与胆汁盐形成乳糜微粒，就会很容易被人体吸收，从而提高人体脂肪酸的吸收率。因此，棕榈酸在甘油三酯上的位置对婴儿的营养吸收有着生理学上的重要意义。Sn-2位棕榈酸可以促进脂肪和钙的吸收，增加骨骼矿物质，降低脂肪酸皂化和大便硬度，对婴幼儿的生长发育有促进作用[14]。

3 人乳脂替代品中甘油三酯的来源

目前，婴儿配方奶粉种类繁多，其中所含的甘油三酯来源主要有4种途径：1)以植物油直接调和；2)以混合油进行随机酯交换；3)以牛奶为基本成分再混合植物油加以调配；4)以Sn-2位富含棕榈酸的油脂或甘一酯与酰基供体通过酯交换来制备[15]。

最初婴儿配方奶粉中的脂肪主要是全脂奶粉中的牛乳脂肪，但是牛乳脂肪与人乳脂相比，脂肪酸组成和结构存在一定差异。牛乳脂肪中棕榈酸的含量约为26%[16]，其中Sn-1位上棕榈酸含量为34%，Sn-2位上棕榈酸含量为32%；而母乳脂肪中棕榈酸的含量为20%～25%，其中Sn-2位上棕榈酸含量约占总棕榈酸的70%[17]，因此母乳脂肪较以牛乳为原料的婴幼儿配方食品更容易被婴幼儿消化吸收。

目前国内多数婴儿配方奶粉改用植物油(主要是棕榈油)代替牛乳脂肪来调整脂肪酸的组成和含量，因为牛乳脂肪含有反式脂肪酸，使用植物油可以减少反式脂肪酸，而且其不饱和脂肪酸含量较高。然而，以棕榈油为主要棕榈酸来源的婴儿配方奶粉，甘油三酯经胰脂肪酶水解成游离棕榈酸，易与金属离子形成不溶性的钙皂，从而导致钙离子和能量的损失[18]。

因此，前3种途径来源的甘油三酯，其总的脂肪酸组成都可以很好地符合人乳脂肪，但Sn-2位脂肪酸组成很难符合，第4种途径则能弥补前3种途径的不足，具有良好的开发前景。

4 酶法制备人乳脂替代品

目前关于人乳脂替代品主要集中于酶法的研究，与传统的化学催化相比，酶法催化反应条件温和，有利于保护营养成分不被破坏，最大的优点是酶专一性强、副反应少、产品容易回收。酶法生产人乳脂替代品的主要目标就是通过Sn-1,3位专一性脂肪酶来催化酯交换或者酸解反应，使产物的物理和化学特性均与人乳脂相似，并且这种新的结构脂质能够应用于类似人乳脂的婴儿营养食品[19]。用酶法代替化学方法来催化油脂改性，可以有效控制酰基转移，具有非常高的研究和应用价值[20]。反应底物、酶的种类及添加量、反应体系、水活度、温度、时间等都将影响酶促酯交换反应速率。通过筛选确定反应的最佳条件，制备出纯度高、副产物少的产品。

4.1 反应底物的选择

酶法酯交换制备人乳脂替代品的底物选择通常是以Sn-2位富含棕榈酸的油脂或甘一酯与酰基供体通过酶法酯交换来制备。棕榈酸主要分布在Sn-2位的原料有棕榈油硬酯[7]、分提棕榈油、猪油[6]等；酰基供体主要选择富含油酸、亚油酸、亚麻酸的植物油或从植物油中提取出混合脂肪酸，按照人乳中脂肪酸的含量来调整各种脂肪酸的比例，将组成合理的酰基供体与底物混合并加入专一性脂肪酶，加入到酶反应器中进行反应[21]。

4.2 脂肪酶的选择

根据反应底物与母乳甘油三酯结构及脂肪酸含量的异同，酶法酯交换制备人乳脂替代品的脂肪酶应该选用Sn-1,3位专一性脂肪酶。目前，应用较广泛的是丹麦诺维信生物酶制剂公司生产的Lipozyme TL M、 Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM，此外，Robles等[10]采用脂肪酶DF催化合成富含棕榈酸和二十二碳六烯酸(DHA)的人乳脂替代品。Sn-1,3位专一性脂肪酶所催化的酯交换反应分两步完成，即水解反应和酯化反应。在脂肪酶的催化下，首先形成中间体甘油二酯(DAG)，并有一小部分水解为甘油一酯( MAG)，DAG再与反应体系中的新脂肪酸酯化从而形成新的甘油三酯。

酶的添加量对酯交换反应效率有一定影响，随着酶添加量增加，反应程度逐渐提高，但酶添加量继续增加，反应会趋于平衡，脂肪酸插入率不再升高，并且酶量增加对酰基转移有促进作用，产生副产物[22]，所以，应在保证一定反应速度的同时，尽可能减少酶用量，不仅可以减少酰基转移的程度和副产物含量，还可以降低生产成本，综合考虑酶的最适用量为5%～10%之间。

脂肪酶的反应温度一般控制在60℃左右，温度过高或过低都会使酶活力下降，反应缓慢，且反应时间不能过长，当反应体系中的甘油三酯被水解60%时，Sn-2位的酰基尚未向Sn-1,3位发生转移，此时需加入乙醇终止反应，对水解产物分离后进行检测。酶只有在一定水分活度条件下才有催化活性，但水活度过高会促进酯水解反应发生而导致副产物形成。因此在酯交换反应中控制水分是十分必要的。在最佳的水活度条件下，酶具有最高的催化活性和选择性。可以采用分子筛、含结晶水化合物、水饱和盐溶液等对水活度进行控制，采用减压干燥等对反应进行即时水活度控制。

4.3 反应体系的建立

脂肪酶催化油脂改性的反应体系主要分为有机溶剂体系、微水条件下的无溶剂体系、微乳液体系和超临界流体。

有机溶剂体系进行酶促反应有许多优势，但是溶剂的使用会造成一定的环境污染，而且大多数溶剂都存在不同程度的毒性，如果溶剂残留则不能食用。无溶剂体系提供了与传统溶剂不同的新环境，是目前较常用的反应体系。酶直接作用于反应底物，反应速度快、产物纯化容易，降低了对环境的污染和回收有机溶剂的成本，但是反应混合物黏度大，往往需要较高的温度。

超临界CO2具有溶解甘油三酯和脂肪酸、保持脂肪酶的活性、不参与化学反应、在适当的情况下易于与产物和底物分离、反应温和且有益于热敏性和易氧化物质的稳定性提高等优点，目前有关超临界CO2介质中的酶促改性油脂反应也有相关研究报道[23]。

4.4 脂肪酸分布位置的检测方法

在评价一种油脂的营养价值时，除考虑其脂肪酸组成外，还应考虑甘油三酯中脂肪酸分布位置，即使脂肪酸组成和含量相同，若脂肪酸的分布位置间存在差异，也会导致油脂在机体内的吸收和利用产生差异进而影响其营养价值。常用的甘油三酯中脂肪酸分布位置检测方法是气相色谱法和液相色谱法。

气相色谱法首先采用薄层层析法(TLC)将甘油三酯进行分离纯化，然后进行甲酯化处理，使一些较难气化的脂肪酸变成可气相检测的脂肪酸甲酯，进而进行气相分析。由于这种甲酯化方法反应时间较长并且反应不够完全，有些学者研究了一步法测定乳制品中的脂肪酸组成，利用乙酰氯与甲醇反应得到的盐酸-甲醇使试样中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，处理方法快速，适合于批量样品的测定[24]。

为了克服气相色谱法流程操作复杂、耗时耗力的缺点，赵海珍等[23]研究开发了一种采用液相色谱法检测甘油三酯中脂肪酸分布位置的方法。首先采用Sn-1,3位专一性脂肪酶对油脂进行水解，生成游离脂肪酸和Sn-2位甘油单酯，然后向水解产物中加入2-溴苯乙酮，利用其只与游离脂肪酸反应的特性，与水解体系中的游离脂肪酸生成苯甲酰甲基酯，然后利用液相色谱对生成的各类苯甲酰甲基酯进行检测，进而得知待测猪油甘油三酯中Sn-1,3位的脂肪种类。将总的甘油三酯中脂肪酸的种类和数量减去Sn-1,3位脂肪酸的种类和数量，即可知道Sn-2位脂肪酸的种类及数量。

4.5 酶促合成人乳脂替代品方法

4.5.1 酶促酸解法

酶促酸解法是甘三酯(TAG)在脂肪酶的催化下与脂肪酸之间发生酰基转移从而改变TAG结构组成的方法[25]。该方法制备人乳脂替代品一般采用Sn-2上富含棕榈酸的TAG以及游离的多不饱和脂肪酸(PUFA)，在Sn-1,3位专一性脂肪酶的作用下进行酶法酸解，将PUFA结合到TAG的Sn-1,3位上，进而研究人乳脂替代品的物理特性以及最佳反应条件。利用酶促酸解法对油脂进行改性，专一性强，有位置和立体选择性等优点，也可避免高温对油脂的破坏。近年来，酶促酸解法生产结构脂质在油脂工业中的应用越来越广泛，但酶法生产价格较高，仅局限于某些特殊领域，如婴儿配方奶粉、制药等，另外，酶生物反应器也是工业化生产的限制因素，相信随着研究的不断深入以及成本的降低，其应用会越来越广泛。

Yüksel等[2]合成的富含亚麻酸的人乳脂替代品是由三棕榈酸甘油酯与游离脂肪酸通过酶法酸解反应产生的，其中游离脂肪酸是从榛子油和一些商品油混合物中获得的，用于催化反应的是Sn-1,3位专一性脂肪酶Lipozyme TL IM。采用响应曲面法获得最佳反应条件是反应温度60℃、反应时间8h、底物物质的量比为4∶1，此条件下的亚麻酸和油酸含量分别增加至2.0、22.9mol/100mol总脂肪酸，Sn-2位上棕榈酸为46.2mol/100mol总脂肪酸，并且，所得的人乳脂替代品的抗氧化性有所提高，与三棕榈酸甘油酯相比有更宽的熔点范围。Nagachinta等[3]酸解棕榈油和从二十二碳六烯酸单细胞油(DHASCO)和花生四烯酸单细胞油(ARASCO)中提取的游离脂肪酸混合物，在正己烷体系中用Novozym 435做催化剂，采用响应曲面法进行优化，最终确定最佳反应条件为底物物质的量比为18∶1、反应温度60℃、反应时间24h，这个条件下获得每100g产物含有25.25g DHA和ARA，Sn-2位上含有17.20g DHA和ARA。这种结构脂质的脂肪酸组成与人乳脂肪相似，可为孕妇提供营养需求。Yang Tiankui等[6]在无溶剂体系中，通过Lipozyme RM IM进行猪油与大豆油脂肪酸的酸解反应，最佳条件为反应温度61℃、反应时间1h、猪油和脂肪酸的物质的量比为1∶2.4、酶添加量13.7%、含水量3.5%，所得产物的特性与中国女性的乳脂相似。Robles等[10]通过四步合成结构甘油三酯，使它在Sn-2位上富含DHA和棕榈酸，Sn-1,3位上富含油酸。首先用非位置专一性的脂肪酶Novozym 435进行催化金枪鱼油和商品棕榈酸酸解，获得富含棕榈酸和DHA的甘油三酯，然后用KOH-乙醇法进行纯化，接着用Sn-1,3位专一性脂肪酶DF酸解富含油酸的游离脂肪酸和所得到的甘油三酯，纯化后获得了Sn-1,3位含67mol油酸、Sn-2位含52.1mol棕榈酸，15.4molDHA的甘油三酯，并且没有检测到游离脂肪酸的残留。Tecelão等[26]通过酶催化酸解反应制备人乳脂替代品，分别研究了无溶剂体系条件下，三棕榈酸甘油酯与油酸(体系1)和ω-3多不饱和脂肪酸(体系2)在60℃时，4种固定化脂肪酶C.parapsilosislipase/acyltransferase、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435在批式操作条件下的酶活性及稳定性。最终得出酶的活性及稳定性取决于使用的酰基供体。Jiménez等[27]在无溶剂体系条件下通过酸解棕榈酸硬酯(含60%棕榈酸、Sn-2位含23%棕榈酸)与富含棕榈酸的游离脂肪酸混合物，生产Sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯，以脂肪酶QLC(固定化于硅藻土)催化反应，最佳操作条件为：反应温度65℃、游离脂肪酸和棕榈酸硬酯的物质的量比为3∶1，最终得到Sn-2位上含80%棕榈酸的甘油三酯。Esteban等[28]通过酶法酸解富含棕榈酸的甘油三酯和富含油酸的游离脂肪酸，合成结构为油酸-棕榈酸-油酸(OPO)的高纯度甘油三酯，作为人乳脂替代品。分别研究了有无正己烷添加时的最佳反应条件。在正己烷体系中，脂肪酶DF催化反应，温度37℃、游离脂肪酸和甘油三酯的物质的量比为6∶1、反应时间1h，该条件下获得了Sn-1,3位含67.2%的油酸、Sn-2位含67.8%的棕榈酸。在无溶剂体系中，温度50℃、游离脂肪酸和甘油三酯的物质的量比为6∶1、反应时间19h，该条件获得的Sn-1,3位含67.5%的油酸、Sn-2位含57%的棕榈酸。Li Yanqi等[29]用lipozyme RM IM酶法酸解牛乳脂与油菜籽油、大豆油混合物，制备人乳脂替代品。并设计了2周饲养小鼠实验，结果表明，合成的人乳脂替代品大大减少了喂养后的小鼠体内钙皂的形成，脂肪与钙的吸收率明显提高。

4.5.2 酶促转酯法

酶促转酯法是指在脂肪酶催化下，两种不同组成的TAG或TAG与简单酰基酯之间发生反应，酯类分子间的酰基发生交换而得到目的脂质的方法[23]。该方法制备人乳脂替代品一般选用植物油混合物或者植物油与动物油混合作为反应底物，调整合适的底物物质的量比，进行酶促转酯反应，近年来，采用该法制备人乳脂替代品与酶促酸解法相比，研究率较低，可能是由于产物TAG中脂肪酸含量可以符合人乳脂肪，但脂肪酸位置并不能很好地符合人乳脂的天然结构，从而会影响婴儿对乳脂的吸收。

Silva等[19]通过Sn-1,3位专一性脂肪酶Lipozyme TL IM，将猪油与大豆油混合物酶法转酯，并描述了产物结构脂质的物理特性和化学组成，转酯反应混合物的固体脂含量、稠度、结晶区域、软化温度等值均减小，使其类似于人乳脂，满足儿童的营养需求。Karabulut等[30]将棕榈油、棕榈仁油、橄榄油、葵花油和深海油脂混合物按质量比为4.0∶3.5∶1.0∶1.5∶0.2混合，通过Lipozyme TL IM酶法转酯，合成与人乳脂结构相似的人乳脂替代品。在配有磁力搅拌的双夹套玻璃反应器内进行反应，在60℃、24h时，产物的总脂肪酸和Sn-1,3位脂肪酸组成与人乳脂相似，但是Sn-2位上棕榈酸含量较人乳脂低，可以通过Sn-2位富含棕榈酸的油脂作为底物进行反应来弥补不足。Maduko等[31]将3种混合植物油添加到脱脂羊奶中，将羊奶中的脂肪酸和固醇改性，使其应用于婴儿配方奶粉中，得出椰子油、红花油、大豆油的体积比为2.5∶1.1∶0.8时，脂肪酸组成以及胆固醇和植物甾醇含量更接近人乳脂。

5 结 语

目前，国外酶法合成人乳脂替代品已逐步从实验室研究阶段转向工业化生产和应用阶段，例如Lipid Nutrition公司的商业化产品BetapolTM，已经被中国卫生部于2008年7月正式批准可作为婴幼儿配方食品添加剂[21]，而国内当前脂肪酶用于油脂改性研究才刚刚起步。这其中的主要原因可以归纳为目前的脂肪酶产量和种类有限，价格较贵，后续纯化问题复杂，另外一些工业技术尚未完全成熟；乳制品的“天然性”问题也成为乳脂生物催化结构化在食品应用中的另一个限制。今后努力的方向一方面是保持投入工业化生产，并且使消费者可以接受酶解产品，另一方面，着重于连续反应的应用，提高催化效率，并且全面评估乳结构脂质的物理性质、营养和氧化稳定性等方面[32]。从脂肪酶的可利用数量和特性来看，酶解方法的进展是快速的，因而酶技术开发母乳脂肪的替代物成为发展趋势且具有良好的开发前景。

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