登革病毒检测技术研究进展

吴忠华，罗鹏，徐琦，何蕾，吕沁风

浙江国际旅行卫生保健中心，浙江 杭州 310003

登革病毒（dengue virus，DENV）感染是人类最常见的虫媒传播病毒病，据WHO统计，目前世界上约有25亿人口有感染DENV的风险，居住在热带和亚热带地区的人群风险较高，全世界每年约有5000万～1亿的DENV新感染者出现[1]。

DENV属于黄病毒科黄病毒属，来源不明，是有包膜的单链RNA病毒，基因组全长约11 kb，编码核衣壳蛋白（C蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）这3个结构蛋白和7个非结构蛋白（NS蛋白），通常通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，有4种抗原性不同的血清亚型，不同亚型的序列有65%～70%的同源性[2]。任何一种亚型都能引起登革热（dengue fever，DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）。大多数感染者无临床症状，只有小部分会出现有症状感染，其中最常见的是DF，其临床表现与感冒引发的急性高热相似；严重的会有DHF，症状包括高热、低血小板计数、出血和血管通透性增加；最严重的是以循环衰竭为特征、危及生命的DSS。DHF和DSS是DENV能引发的最严重症状，且在儿童和15岁以下青少年中更为常见。目前仍无针对DENV的有效疫苗上市，但早期发现和治疗干预可降低其致死性，因此DENV检测技术的研究对早期诊断治疗、降低致死率具有极其重要的意义。

1 DENV的分离培养法

DENV血症可在发热前2～3 d至初次感染开始后5 d或再次感染后4 d内检出[3]，这段时间内患者的外周血、血清或血浆样本都可分离出病毒。常用分离方法有敏感细胞培养分离、成年蚊虫胸腔接种分离和乳鼠脑内接种分离。

1.1 蚊虫胸腔内接种

蚊虫胸腔内接种是敏感性最高的病毒分离方法，4种血清型DENV的分离率为71.5%～84.2%[4]。病程早期（前4 d）的样本接种可获得更高的分离率（85.3%），4 d后分离率为65.4%[4]，且初次感染病人的病毒分离率（91.0%）高于再次感染者（77.6%）[3]。

1.2 乳鼠脑内接种

出生2～4 d乳鼠脑内注射病人血清或血浆样本，每日观察，在死前取脑分离DENV[5]。

1.3 敏感细胞系培养分离

蚊虫和乳鼠脑内接种分离病毒对技术、安全性和可行性要求高，花费也高，故敏感细胞系培养分离更加常用。常用的敏感细胞包括蚊虫传代细胞系，如白纹伊蚊细胞C6/36、伪盾伊蚊细胞AP-61、安波巨蚊细胞Tra-284、CLA-1蚊虫细胞，或哺乳动物细胞 LLC-MKZ、幼仓鼠肾细胞 BHK21、Vero细胞、Ve⁃ro-E6细胞等。细胞培养分离法的灵敏度只有约40.5%[6]，且有少数毒株可能不引起细胞病变，此类病例不能通过细胞接种的方法检出。

除直接用于诊断外，病毒分离法还为体外实验如基因测序、病毒中和及感染实验提供病毒。病毒分离法诊断DENV的优点是可靠，适用于感染早期的疾病监测，缺点是耗时较长。因此，病毒分离法目前已极少用于临床诊断。

2 DENV的血清学检测方法

感染DENV后的急性期后期，血清学检测是较好的方法。DENV的常用血清学检测方法包括血凝抑制试验（hemagglutination inhibition，HI）、空斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）、间接免疫荧光抗体试验（indirect immunoflu⁃orescence assay，IFA）、IgM/IgG捕获ELISA法、补体结合试验、免疫斑点试验（dot immune-binding as⁃say，DIBA）、免疫印迹和快速层析法。

2.1 血凝抑制试验

血凝抑制试验敏感性高，重复性好，操作简便，检出率高于病毒分离法，曾是DENV血清学检验的金标准。此法的优点是试验所需试剂配制方便，可根据血清滴度的不同判断初次感染或二次感染，HI滴度≥1∶2560则为二次感染，＜1∶2560则为初次感染。血凝抑制试验也有诸多缺点：①待检测的血清样本必须先经预处理，以去除红细胞凝集的非特异性抑制剂；②准确的HI测试需要急性期和恢复期的血清样本，急性期和恢复期血清样本的滴度相差4倍或以上才能确诊近期感染；③方法缺少特异性，不能区别DENV感染和其他相近种类的病毒感染，如乙型脑炎病毒、西尼罗河病毒感染，因此在其他黄病毒感染也高发的地区使用受限；④易发生交叉反应且不能区分DENV的血清型。因此，血凝抑制试验现已逐渐被其他更加快速准确的方法所取代。

2.2 空斑减少中和试验

空斑减少中和试验可用于检测感染过DENV的患者的血清分型。基本方法是在不同稀释率的病人血清中加入定量的病毒，接种到预先准备好的单层细胞中培养数天，统计蚀斑数，计算该血清的蚀斑中和效价。最终滴度是使蚀斑减少50%～90%的血清的最高稀释率。DENV初次感染者的血清能使蚀斑数减少90%[7]。二次感染和抗体依赖性增强实验中，PRNT试验阳性反应中蚀斑减少50%～70%[8]。PRNT是鉴别不同种类黄病毒的血清学检查金标准[9-10]。传统PRNT法的缺点是耗时较长，需要活病毒，对操作人员技术要求高，且不能用于大量临床或流行病学样本的高通量分析。目前已有基于PRNT的改良法，使用伪病毒报告颗粒可有效检测DENV的4种血清型[11]。

2.3 IgM/IgG捕获ELISA法

此法的基本过程是以人抗IgM或IgG包被酶标板，病毒抗体、病毒抗原、二抗和酶按顺序相互结合孵育，最后用分光光度计检测显色程度代表不同滴度。鼠脑来源的病毒血凝素抗原或细胞来源的病毒抗原都可作为病毒抗原使用，两者的敏感性和特异性并无显著差异[12-13]。目前IgM/IgG捕获ELISA法是判断初次感染和再次感染的常用指标[14]。

目前已有多种商品化ELISA试剂盒可用于DENV抗体检测，特异性和敏感性也很不错。ELISA法的优点是操作方便迅速，IgM-ELISA可检测出近期感染，IgM与IgG的吸光度比值可鉴别是初次还是二次感染。但ELISA法有2个缺点，一是血清中的风湿因子会影响DENV IgM的检测特异性[15]，二是ELISA法用全部病毒抗原来检测登革特异性抗体，4个血清型之间易产生交叉反应。

3 DENV的分子生物学检测方法

与传统的病毒分离法相比，分子生物学检测方法的敏感性更高、更快速，十几年来发展迅速，有良好的应用前景。

3.1 依赖核酸序列的扩增技术

依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid se⁃quence-based amplification，NASBA）是一种以 RNA为模板进行等温核酸扩增的方法，可用于DENV扩增[16-17]。此法借助逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和2对特异性引物实现。这种化学发光法操作简便，灵敏度为98.5%，特异性为100%[17-18]，可检测样本中低于25 PFU/mL的DENV RNA，适合在登革暴发地区快速检测。

3.2 环介导等温扩增法

环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种等温扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可高效、快速、高特异地扩增靶序列。利用链置换DNA聚合酶在等温（63℃左右）条件下保温30～60 min即可完成核酸扩增反应。LAMP的结果判断有多种方法，阳性产物电泳可见特殊的阶梯状条带，或加入荧光染料观察荧光强度，或颜色改变判断是否为阳性反应，借助副产物焦磷酸镁沉淀离心后产生白色沉淀，或通过浊度仪实现定量。该方法适合基础条件较为薄弱的基层或现场实验室，反应时间短，不需要特殊仪器设备，肉眼可观察结果，具有很强的实用性。LAMP技术目前在国内外得到广泛推广及应用，RT-LAMP法可用于DENV检测[19]。

3.3 转录介导的扩增方法

转录介导的扩增方法（transcription mediated amplification，TMA）是目标序列单链RNA在逆转录酶作用下，引物1引导进行逆转录，形成RNA/DNA杂交双链分子，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解后，引物2引导合成双链DNA，由于在引物1上设计有T7启动子结合区，双链DNA在T7RNA多聚酶作用下转录出100～1000个目标RNA序列，这些RNA又可作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。TMA检测DENV RNA在RT-PCR检测阴性的急性期血清样本中有80%的检出率，在RT-PCR检测阳性的急性期血清样本中检出率达100%，即总检出率达89%[20]。

3.4 实时PCR法

实时PCR（real time-PCR，RT-PCR）是目前快速诊断DENV的最好方法之一，灵敏度范围58.9%～100%，检测阈0.1～3.0 PFU[21-27]。RT-PCR的定量用荧光色素实现，目前常用的2种是能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的荧光探针如TaqMan探针，以及能在双链DNA中插入的特异荧光色素如SYBR greenⅠ。由于SYBR greenⅠ可结合到任何双链DNA，包括引物二聚体和非特异性产物上，影响目标产物的浓度检测，因此对引物的要求较高。TaqMan荧光探针杂交法只能在单管mRNA上使用，试验费用较高昂。

RT-PCR引物来自DENV基因组的不同区域，可用于临床检测DENV及确定血清型。Lanciotti最早建立的两步法巢式RT-PCR中[28]，2组与C/prM区对应的引物比较常用，包含用于第一轮扩增的外引物及鉴定4种血清型的特异性引物。经过2次PCR扩增，病毒基因组的信息量扩大，有助于提高检测的敏感性，方便检出病毒，同时还可鉴定具体的血清型及分辨混合感染。

为降低样本交叉污染带来的假阳性，Harris等建立了一种单管复式RT-PCR法[29]，对1～4血清型DENV的最低检测阈分别为1、50、1、30 PFU。有研究证明一步法比两步法具有更高的检出率[30]，值得临床实验室推广。

目前RT-PCR法和其他方法联用诊断DENV越来越常见。如将一步法RT-PCR与单酶切-限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）相结合，可以更快速有效地鉴定DENV分型。Vorndam首先报道了RT-PCR/RFLP技术可鉴别DENV的地理亚群，但需要扩增整个病毒基因组[31]。经Gaunt和Gould改进后，RT-PCR/RFLP法可鉴别90%的已知E基因序列的黄病毒。2012年Ortiz等建立了一种新的一步法RT-PCR与单酶RFLP法结合，只需24 h就可鉴别DENV的4种血清型、黄热病病毒、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎病毒，且特异性高于95%[32]。

由于PCR反应的引物、酶、缓冲液、反应条件、病毒的基因组靶区域和PCR仪都可能影响PCR结果，而各地的条件都不相同，因此很难界定哪一种分子生物学检测方法更好，需要结合本地的实际条件加以应用。各种分子生物学检测方法的标准尚未统一，需要进一步研究摸索，相关的分子学检测试剂盒也正在开发。

3.5 生物传感器

生物传感器是生物诊断设备，既可定性也可定量检测[33]，具有快速、灵敏、特异性高的优点，如能实现便于携带、自动化程度高的试剂盒商业化要求，将会有很好的应用前景。DENV生物传感器在2000年开始出现，并不断得到改进[34-40]。

人类的基因组DNA可能会影响病毒RNA的选择，因此生物样本的纯化和化学修饰十分重要。微流体设备（芯片实验室）和基于一次性芯片的技术可用于样本预处理，然而考虑到场地要求、设备要求和资金能力，这些设备可能不完全适于快速检测试验的基本要求。当前大多数DENV生物传感器类型为压电晶体生物传感器、光生物传感器和电化学生物传感器[33]。

在压电式传感器中，2种不同的单克隆抗体固定在一个压电式传感器上，它们之间是一个免疫芯片，传感器可探测糖蛋白E和非结构蛋白NS1[41]，还有的使用分子印迹聚合物来识别登革病毒NS1蛋白的抗原决定部位[42]。这样的设计规避了合成单抗的使用，可获得较高的灵敏度和特异性[35]。最近，芯片技术发展为通过互补的寡核苷酸特异性杂交进行逆转录PCR，效果与RT-PCR相同[43-44]。此方法易发生内源性和外源性互相干扰，因此对实验设备的要求很高。

一种化学发光的光学纤维免疫传感器能与酶联免疫吸附法获得类似的DENV检测效果，且灵敏度更高，或可用于无症状患者的检验[35]，它的缺点是重复性差。其他利用光学途径的方法如磁珠、脂质体、报告探针等仍需要昂贵和复杂的分析仪器，复杂的数据处理或其他电子设备，花费多，设备不易携带，不易商业化[33]，限制了它们的临床使用。

4 结语

DENV的暴发和流行给社会带来很大负担，DENV疫苗可能在5～7年后上市[45-47]。对患者而言，DENV快速准确的诊断必不可少，即便以后有疫苗和抗DENV药物上市，DENV的检测技术作为评价其效果的手段也是非常必要的。考虑到病毒变异的可能，以及DENV检测技术随着医疗技术水平的不断提高，未来的检测技术很可能在分子水平上进展得更深更远。

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