结核分枝杆菌抗原检测研究进展

戴振华 ，郭兰芹 ，张贺秋 ，冯晓燕

1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850；2.华北石油总医院，河北 任丘 062552

结核病（tuberculosis，TB）是一种古老的疾病，由于缺乏有效疫苗，缺乏高特异性和敏感性诊断试剂，以及耐药性结核病的不断涌现等原因，该病仍然是全球公共卫生的重大威胁，每年有超过200万人死于TB[1]。2009年世界卫生组织发布报告，2008年中国TB发病100万～160万人，仅次于印度，居世界第2位。因此，TB的预防和控制在我国显得尤为重要。

有效控制TB的障碍在于缺乏早期、准确的诊断方法。分枝杆菌培养是诊断的金标准，但耗时长且相对昂贵；涂片镜检法检出率低；分子生物学检测技术对实验设备和操作要求较高，易出现假阳性结果；特异性的细胞免疫检测，因在发展中国家人群中结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的潜伏感染率高，不适合推广使用；临床症状及胸部X线检查结果不是特异性的，需要其他辅助诊断。再者，肺外结核、艾滋病合并感染的TB、婴幼儿感染的TB、菌阴TB的诊断对上述方法都是巨大的挑战。

机体受到MTB感染后,体内首先出现的是MTB特异性抗原。因此，MTB抗原检测作为TB早期诊断方法可能具有很高的应用价值。

1 MTB抗原检测的方法

1.1 凝集试验

凝集试验是颗粒性抗原与相应抗体，或表面包被抗原（抗体）的颗粒状物质与相应抗体（抗原）在电解质存在的条件下相互结合，出现肉眼可见的凝集团现象。1984年，Krambovitis等首次报道了胶乳凝集试验在TB诊断中的应用[2]。Sada等使用协同凝集技术检测活动性TB患者标本中的脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomanna，LAM），涂片阳性患者血清检测的敏感性为88%，抗酸杆菌阴性患者痰液检测敏感性为67%，在人免疫缺陷病毒（HIV）和TB共感染患者中检测的敏感性为57%，但特异性达到100%[3]。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是一种酶联免疫技术，用于检测包被于固相板孔中的待测抗原或抗体。即用酶标记抗体，将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。1983年，Sada等首次用双抗体夹心ELISA（sELISA）检测脑脊液（CSF）中MTB抗原，取得了较为理想的结果[4]。其后国内外众多学者应用sELISA方法对MTB抗原的检测进行了探索，检测了CSF[5-6]、痰液[7]、血清[5,8-10]和尿液[11-15]标本中的MTB抗原，汇总敏感性为44%～91%，汇总特异性为86%～100%。

1.3 免疫斑点法（dot immunobinding assay，Dot-Iba）

Dot-Iba是继ELISA后发展起来的另一形式的固相标记免疫测定法，其特点是以微孔膜为载体，阳性结果在膜上出现着色斑点。与ELISA法相比，Dot-Iba操作更为简单，所需试剂少，结果肉眼可见，检测结果可长期保存，不需特殊设备，易于普及和推广。Deodhar等采用Dot-Iba，不仅可检出88.88%的痰涂片阳性-培养阳性病例，也能检出81.89%涂片阴性-培养阳性病例。如果涂片和斑点印迹ELISA的结果相结合，91.08%的培养阳性病例可被检出[16]。

1.4 免疫金标技术

该技术是在Dot-Iba基础上发展起来的一种新型免疫学标记和检测技术，主要包括免疫金标层析法和免疫金标渗滤法（Dot-immuogold filtration as⁃say，DIGFA）。与ELISA和Dot-Iba技术相比，其操作更为简便、快速，可将检测时间缩短至5～15 min，且检测的敏感性和特异性保持不变。Stavri于2003年首先应用DIGFA技术检测了TB患者血清和痰液中的 MTB 抗原[17]。Fabre[18]、Ben-Selma[19]、Alavi-Naini[20]等使用Patho-TB试剂盒（Anda Biologicals，法国）检测TB患者痰液标本中的MTB抗原，敏感性为89.5%～95%,特异性为70.2%～100%。

1.5 免疫荧光技术

免疫荧光技术是将已知抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体或抗原作为分子探针检测标本中相应的抗原或抗体。何俊瑛等利用免疫荧光技术对30例TB患者和30例正常人的CSF中单核细胞内的MTB抗原进行了检测，敏感性为83.3%，特异性为100%[21]。Mukundan等在免疫荧光技术的基础上用波导光学生物传感器，在很短时间内定量检测HIV阳性TB患者血清和尿液中的LAM、早期分泌性抗原靶6（ESAT6）和抗原85复合物（Ag85），与ELISA相比灵敏度大幅度提高[22]。

2 MTB抗原检测中的靶抗原

2.1 菌体细胞

将MTB减毒株H37Ra或卡介苗（BCG）株进行超声破碎，用抽提物免疫动物，获得anti-H37Ra或anti-BCG血清，作为待检抗原的捕获抗体。Sada等首先以sELISA法检测TB患者CSF中的BCG抗原，检测敏感性为81.25%，特异性为95%[4]。Venkatesh等通过反向被动血凝试验（RPHA）检测CSF中的MTB抗原，检测敏感性为50%，特异性为80%[23]。

2.2 结核菌素的纯蛋白衍生物（PPD）

PPD在早期MTB抗原检测中有所研究。Sood等用sELISA检测肺结核和结核性脑膜炎（TBM）患者血清和CSF标本中的PPD，在血清中的检测敏感性为73.3%，特异性为83.8%；在CSF中的检测敏感性为76.4%，特异性为80.6%[24]。Mathai等用Dot-Iba技术检测了30例TBM患者与40例正常受试者CSF中的PPD，检测敏感性为83.3%，特异性为95%[25]。

2.3 脂阿拉伯甘露聚糖

LAM是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，包含9个单克隆抗体结合表位，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是TB血清学诊断应用较广的抗原。很多学者对体液中LAM的检测进行了研究，特别使人感兴趣的是近几年连续有报道在TB患者血清[9,26]、尿液[11-12,14-15,27]、痰液[7，28]及肺外结核患者的胸腔积液和CSF中[29-30]检测到LAM抗原，检测的敏感性为50%～91%，特异性为69%～100%。Dheda[31]、Lawn[32]和Mutetwa[13]的研究表明，HIV和TB共感染患者尿中LAM的检测灵敏度明显高于非共感染患者，也显著高于痰镜检，LAM的检出率与低CD4细胞计数和临床分期密切相关。说明尿LAM的检测可预测TB免疫重建疾病的发展。

2.4 MPT64

相对分子质量（Mr）为 24×103，又名 MPB64，是MTB短期培养物滤过蛋白的主要成分之一，是最早被发现的MTB特异性抗原。MPT64可被大多数TB患者和结核感染者的免疫系统所识别，它既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应。Kumar等用免疫层析法对从肉汤和罗氏培养基上培养分离的54株MTB菌株及12株非MTB菌株进行MPT64抗原检测，得到的敏感性和特异性均为100%[33]。

2.5 14kD抗原

14kD抗原是从MTB培养滤液中分离出来的蛋白。Sumi等用14kD抗原免疫兔子，获得相应抗血清，应用Dot-Iba和PCR技术同步检测37例TBM患者和45例正常受试者CSF中的14kD抗原，Dot-Iba检测的敏感性是75.7%，高于PCR的40.7%，两者的特异性均为100%[34]。

2.6 38kD抗原

38kD抗原是一种定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合群中表达，表达量是BCG的10倍，免疫原性强。38kD蛋白可刺激T细胞和B细胞免疫应答。刘志广等用抗38kD蛋白的单克隆抗体，通过直接免疫荧光检测法对41份TB患者的痰标本进行检测，敏感性为90.24%，显著高于抗酸染色法的73.14%[35]。

2.7 31kD抗原

31kD抗原是一种丝氨酸蛋白酶抗原，从结核分枝杆菌H37Ra株培养基中得到。Bera等通过ELISA法检测20例TBM患者CSF和血清中的31kD抗原及抗体。结果表明，在CSF中检测31kD抗原的敏感性为90%，特异性为96%；检测31kD抗体的敏感性为85%，特异性为96%。在血清中检测31kD抗原的敏感性为80%，特异性为96%；检测31kD抗体的敏感性为80%，特异性为94%[36]。

2.8 Ag85复合物（Ag85）

Ag85是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白,Mr为30×103～32×103，具有MTB种特异性和属共同抗原决定簇，分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。Ag85复合物由3种同源蛋白质Ag85A、Ag85B及Ag85C组成，其中有免疫作用的主要为Ag85A和Ag85B。Kashyap等通过sELISA检测128例TB和69例非TB血清样本中的Ag85复合物，检测的敏感性为82%，特异性为86%[8]。

2.9 HSP65抗原

HSP65属于MTB热激蛋白（HSP）家族，在MTB感染人体后，HSP65会诱导宿主产生较强的体液和细胞免疫反应。Mudaliar等用抗HSP65单抗，对80名TB患者和80名对照受试者CSF中的HSP65抗原进行检测，敏感性为82.5%，特异性为90%[6]。Rajan等用抗HSP65单抗，通过ELISA法对188名TB患者和116名对照血清样本中HSP65抗原进行检测，敏感性为82%，特异性为89%[10]。

2.10 培养滤液蛋白10（CFP-10）

CFP10是低分子量分泌蛋白，由MTB的RD1区基因编码，仅存在于致病性MTB中，BCG及其他非致病性分枝杆菌中则不存在。Stavri等用ELISA检测痰标本中的CFP-10抗原和血清中的CFP-10抗体，Dot-Iba检测痰液中的抗原，敏感性为86.1%，特异性为92.9%；ELISA检测血清中的抗体，敏感性为83.6%，特异性为95.4%[37]。

2.11 其他相关的MTB靶抗原

Chanteau等发现，45/47kD抗原检测的敏感性较低，小于40%，特异性为95.6%，抗-45/47kD抗体检测敏感性为76.9%，但特异性低，为73.2%[38]。El-Masry等用Fast-Dot-ELISA检测TB患者血清中的20kD抗原，敏感性为90.8%，特异性为89.6%[39]。Attallah等用Dot-ELISA检测TB和肺外TB患者血清中的55kD抗原，敏感性分别为87%和90%，而特异性均为97%[40]。张周云等采用sELISA检测了139例活动性TB患者、64例非TB肺部疾病患者和29例健康对照者血清中的MTB分泌蛋白desA抗原，敏感性为84.1%，特异性为92.19%[41]。

3 问题与展望

MTB抗原检测作为TB早期诊断的方法备受关注，机体受到MTB感染后，体内首先出现的是MTB特异性抗原，TB抗原检测不受宿主免疫功能状态的影响，可作为MTB存在的直接证据，避免了由于结核菌的抗原性较弱，或属间和种间共同抗原决定簇的存在，以及TB患者免疫应答低下等原因导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的假阴性。TB具有高度传染性，在MTB感染初期，对这种疾病早期、准确的检测，不仅能控制TB的蔓延，也能帮助医生开始恰当与及时的治疗。

近20年来，在MTB抗原检测研究方面，除了LAM外，对其他特异性抗原的靶向研究较少，而且由于特异性单克隆抗体制备困难，待检样本及处理方法没有形成标准化，以及大多数研究只关注方法学质量，导致MTB抗原检测在临床上的应用较少，因此MTB抗原检测仍然存在较大的研究空间。TBM是最严重的肺外结核病，常呈急性或亚急性起病，病程慢，常缺乏结核接触史，其临床表现缺乏特异性，且病情变化迅速，需要进一步研究确定对TBM患者进行特异性抗原检测的价值。未来的研究也需要评价在HIV感染并涂片阴性的TB患者中抗原检测的性能。同时也要探讨待检MTB抗原的浓度与痰液中MTB密度之间的关系，以了解患者治疗前后的疾病状态，从而有助于监测治疗是否成功及早期识别治疗是否复发。

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