中国栗属植物花粉萌发特性研究

田寿乐，孙晓莉，沈广宁，许 林

（山东省果树研究所，山东 泰安 271000）

花粉是植物种质的形式之一，具有丰富的遗传多样性，因其含有该物种的所有基因类型，已被广泛用于种质保存、交换以及新种质创新等研究领域，如在解决杂交育种中花期不遇问题和开展异地授粉、定向育种工作时具有很强的可操作性。但在自然条件下，许多花粉的寿命非常短，各种环境因素如温度、湿度、水分、大气成分、大气压力等均可影响花粉活力。Beny等人[1]发现，高浓度的 CO2（800 μmol·mol-1）能缓和由于高温而造成的花粉活力下降，但O2则有相反的作用。另外，由于种质间的遗传差异性，花粉萌发特性千差万别，因此给种质保存及创新带来困难。板栗Castanea mollissimaBl.、日本栗C. crenataSieb. & Zucc.、 茅 栗C.seguiniiDode和锥栗C.henryiRehd. & Wils.同属山毛榉科 Fagaceae 栗属Castanea，是我国栗属植物的主要种，在我国均有大范围的分布，在部分地区常处于混生状态。据报道，栗属不同种的植物可相互杂交，并产生了自然杂交种，如‘曹苟栗’[2]、‘利平栗’[3]等。为深入利用我国现有栗属植物的优势资源，实现新种质创新，开展对栗属花粉的研究尤为必要和迫切，但目前有关栗属花粉特性等基础性研究的报导甚少，相关研究多集中于新品种选育、栽培技术及采用处理等应用领域。文中以中国栗属4个种的花粉为材料，研究了不同培养条件对花粉萌发率的影响，以期为栗属花粉的长期保存和种间杂交授粉提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为板栗、日本栗、茅栗和锥栗在盛花期的花粉，均采自山东省果树研究所板栗资源圃里的实生树，树龄5～8年，生长正常。

1.2 试验方法

试验于2011年5月至2012年5月进行。雄花序当天采集后阴干晾晒12 h，然后放入干燥器内于0、－20、－70 ℃下保存备用。对培养基糖类组分及质量浓度、培养温度、培养时间、干燥时间、播散密度及贮藏温度进行单因素筛选。设置9种固体培养基，各组分及配比如表1所示，高温灭菌充分冷却后接种花粉。培养温度设置为5个水平：24、27、30、33、36 ℃；花粉干燥采用室内自然晾晒法，设置5个水平：0、12、24、36、48 h；花粉播散密度设置4个水平：（100±10）粒/视野、（250±25）粒/视野、（400±40）粒/视野、（550±55）粒/视野；培养时间设置6个水平：6、12、18、24、30、36 h；贮藏温度设置3个水平：0、－20、－70 ℃。培养过程中各处理光照强度均设定为12×103Lux。各单因素试验均在其它因素最优情况下进行。花粉萌发以花粉管长度超过花粉赤道轴长度的1倍为准。用Olympus-CH显微镜40×物镜下测量萌发前花粉极轴和赤道轴长度，50个重复。每处理设置3个玻片，每个玻片随机观测5个视野。

表1 培养基处理及组分Table 1 Treatments and compositions of media

1.3 数据处理

采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析（LSD法）；制图采用 Excel 软件。显著性水平设定α=0.05。

2 结果与分析

2.1 花粉形态

栗属4种花粉形态特征如表2所示。由表2可知，4种栗属植物花粉形状基本一致，均为长椭圆形，极轴15.1～21.5 μm，赤道轴5.6～9.7 μm；外壁轮廓较平滑，具3条萌发沟，沟细长，并延伸至两极，花粉管着生在萌发沟中部，仅从形态上4种花粉难以区分。经P×E测算，花粉粒大小依次为板栗、茅栗、锥栗、日本栗，其中板栗花粉极轴和赤道轴长度分别达到19.6 μm和8.4 μm，均显著高于其它3种栗属花粉，这与马常耕等人[4]的描述基本一致。茅栗P/E值为2.2，略小于其它3种栗属花粉，形态上表现为稍细长。

表2 4种栗属植物花粉的形态特征†Table 2 Pollen morphology of the four species in Castanea

2.2 培养基糖类组分及浓度对栗属花粉萌发率的影响

糖类不仅为细胞生长提供C元素，而且在用固态培养基进行花粉培养时还起到维持细胞水势的作用，避免了花粉因过度吸水而导致膨胀，并影响到萌发。本实验不同培养基组分及配比对栗属花粉萌发率的影响如表3所示。从表3分析可知，在无添加任何糖类组分的情况下，对照组栗属花粉均处于极低的萌发率，且花粉粒膨胀严重，P/E可达1.1，近似圆球形。培养基糖类浓度对花粉萌发率影响非常明显，4种栗属花粉均以5%浓度水平萌发率最高，其次为10%和15%浓度水平，表现为萌发率随糖类浓度的升高而降低，同时表明栗属花粉萌发对最佳糖类浓度的选择性趋于一致。试验表明，不同糖类组分对栗属花粉萌发率的影响较为复杂，以5%浓度水平为例，板栗和日本栗花粉在砂糖培养基上的萌发率最高，葡萄糖培养基上最低；锥栗在砂糖培养基上萌发率也最高，但在蔗糖培养基上最低，二者相差达13.2%；茅栗在蔗糖培养基上萌发率最高，在葡萄糖培养基上最低，二者相差6.0%。在蔗糖组分下，板栗花粉在5%浓度水平的萌发率最高，达到81.5%，显著高于10%和15%浓度水平 ，这与结果夏仁学[5]在板栗上的研究相似，但与谢治芳[6]的研究结果存在一定差异。由此可见，在糖类5%浓度水平，4种花粉均保持了较高萌发率，其中砂糖可作为板栗、日本栗和锥栗花粉培养的首选糖类组分，蔗糖则可作为茅栗的首选糖类组分。

表3 不同培养基对4种栗属植物花粉萌发率的影响Table 3 Effect of different media on pollen germination rates of the four species in Castanea %

2.3 培养温度对栗属花粉萌发率的影响

植物花粉萌发所需温度是由自身生理特征决定的，只在适宜的温度区间具有较高萌发率，且这个温度区间因物种不同相去甚远。一般在早春开花的植物其花粉萌发所需温度较低，如榛子花粉萌发仅需10 ℃[7]，风信子品种‘安娜玛丽’花粉离体培养最适温度为15 ℃[8]，大樱桃花粉萌发的适宜温度为18～25 ℃[9]。板栗等4种栗属植物盛花期一般在5月底至6月上中旬，期间气候炎热干燥，显然栗属花粉萌发已适应这种气候特点。室内不同培养温度对栗属花粉萌发率的影响如图1所示。4种花粉在24 ℃时基本不萌发，在27 ℃萌发率保持在较低水平，约10%～17%。当温度由27 ℃上升至30 ℃时，各种花粉萌发率均大幅提高，其中日本栗萌发率达到最大值73.1%，此后随温度升高呈缓慢下降趋势。结合日本栗盛花期较早的特点，可初步判断日本栗花粉萌发特点可能与其盛花期温度稍低有关。当培养温度上升至33 ℃时，板栗、茅栗和锥栗萌发率均达到最高，分别为78.0%、77.3%和76.8%，这一结果与夏仁学[5]在板栗上的研究略有差异，符合郑诚乐[10]对锥栗的试验结果。经上述分析可知，30～36 ℃较适宜栗属花粉萌发，且4种栗属花粉萌发率均保持在50%以上。

2.4 培养时间对栗属花粉萌发率的影响

植物花粉萌发所需时间存在很大差异，少则十几分钟，多则几十小时。枣花粉萌发速度较快，在适宜温度下培养0.5 h萌发率即在60%以上[11]。梨在适宜条件下培养3 h萌发率达到67%以上[12]；桃花粉萌发率在培养前3 h内上升最快，3～5 h上升趋势减弱，5 h后基本停止[13]。培养时间长短对栗属花粉萌发率的影响如图2所示，栗属花粉萌发需要较长时间，在整个培养过程中，各种花粉萌发趋势基本相同，萌发率均呈“S”型曲线增长。从图2可以看出，在0～6 h内各种花粉萌发率均处于较低水平，至6 h时萌发率最高也不超过10%；在6～24 h内，随着培养时间延长，各种花粉萌发率大幅上升，其中板栗增长幅度最大，每小时增长率达到3.6%；在24～36 h内4种花粉萌发速率放缓，花粉萌发数量较前期明显减少。培养至36 h，各种花粉萌发率达到最大值，板栗萌发率最高，为79.6%，其次为日本栗、锥栗和茅栗。

图1 培养温度对栗属花粉萌发率的影响Fig.1 Effect of culture temperature on pollen germination rate in Castanea

图2 培养时间对栗属花粉萌发率的影响Fig.2 Effect of culture time on pollen germination rate in Castanea

2.5 干燥时间对花粉萌发率的影响

花粉干燥是花粉贮藏过程中必不可少的环节，其一有助于花粉从花粉囊中散落，其二可降低花粉中的水分，利于干燥保存。干燥时间长短其实质是影响花粉自身含水量，适度干燥可提高萌发率，而过度干燥则导致萌发率下降。干燥时间长短对栗属花粉萌发率的影响如图3。采后未经干燥的4种栗属花粉萌发率均在70%左右，经过12 h晾晒后，4种花粉萌发率均有所上升并达到最高，其中板栗花粉萌发率上升幅度最大，较未干燥处理提高了8.4%，日本栗上升幅度最小，提高了3.3%。干燥时间超过12 h后，各种花粉萌发率呈明显下降趋势，干燥至24 h时，4种花粉萌发率下降至干燥前水平。超过24 h后，各种花粉萌发率随干燥时间延长呈加速下降趋势，至48 h降至最低，其中日本栗下降速度最快，萌发率降至29.4%，茅栗花粉萌发率稍高于其它3种，但也仅为39.2%。

图3 干燥时间对栗属花粉萌发率的影响Fig.3 Effect of drying time on pollen germination rate in Castanea

2.6 花粉密度对萌发率的影响

花粉萌发具有集体效应，即在一定面积内，花粉数量越多萌发越好[14]，这一点在栗属植物上均得到充分体现。不同花粉密度对栗属花粉萌发率的影响如图4所示。4种栗属花粉在低密度水平均保持较低萌发率，密度为100粒/视野和250粒/视野时，4种栗属花粉萌发率极低，平均仅达到在10%左右，其中日本栗花粉萌发率明显低于其它3种；花粉播撒密度增大至400粒/视野时，各种花粉萌发率均显著上升，茅栗萌发率最高，为36.0%。当花粉密度达到550粒/视野时，4种花粉萌发数量骤增，萌发率均跃居65%以上，其中日本栗最高，达到79.5%，萌发率较100粒/视野水平时提高了近98倍。据此可知，花粉密度与花粉萌发率呈明显正相关，为保证高质量的授粉受精效果，应尽量提高授粉密度，并且这在人工杂交育种时尤为重要。

2.7 贮藏温度对花粉萌发率的影响

低温、超低温贮藏是目前花粉保存最常用的方法，已经涵盖了农作物、果树、蔬菜、药材、牧草、经济作物以及园林植物等[15-23]，对种质资源保存和杂交育种意义重大。不同贮藏温度对花粉萌发率的影响如表4所示。由表4分析看出，在相同低温处理下4种花粉随贮藏时间延长其萌发率均有不同程度下降。总体来说，－20 ℃贮藏效果要明显好于0 ℃和－70 ℃。在－20 ℃低温下贮藏30 d时，各种花粉萌发率依然保持在高水平，平均萌发率高达73.8%；至贮藏360 d时，4种花粉平均萌发率仍达到23.4%，远高于0 ℃和－70 ℃处理；在此温度下，板栗花粉萌发率月平均下降幅度最大，为5.2%，日本栗最小，为3.7%。－70 ℃处理效果稍好于0 ℃处理，在贮藏至360 d时4种花粉仍有少量萌发。0 ℃处理下各种花粉萌发率均较低，最主要原因可能是该温度未能有效抑制花粉呼吸作用，导致能量大量消耗所致，因此0 ℃最不适合4种花粉的长期贮藏。

图4 花粉密度对栗属花粉萌发率的影响Fig.4 Effect of pollen density on pollen germination rate in Castanea

表4 贮藏温度对花粉萌发率的影响Table 4 Effect of storage temperature on pollen germination rate %

3 讨 论

3.1 栗属花粉形态

中国栗属4种花粉形态基本一致，具有相似的萌发孔沟，且花粉管萌发位置均位于萌发沟中部，其形态与石栎属Lithocarpus和锥属Castanopsis[24]花粉非常相似，在光学显微镜下难以区分。经P×E测算，花粉粒大小依次为板栗、茅栗、锥栗、日本栗。

3.2 影响栗属花粉萌发的因素

对于大多数植物而言，花粉萌发受温度、湿度、花粉密度、糖类种类等环境因素和自身生理因素的影响[25]。糖类物质是花粉萌发及花粉管生长的重要能量物质，在花粉试验中多采用蔗糖作为糖类添加物，也有用葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖甚至多种糖类混用的报道[26-27]。本试验探讨了单糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）及砂糖（含单糖、二糖、多糖）对栗属花粉萌发的影响。结果表明，栗属4种花粉对不同糖类组分及其浓度的选择具有专一性，在不含糖培养基上各种花粉几乎不萌发，而在5%糖类浓度下各种花粉萌发率均显著高于10%和15%的浓度处理，这与赵长星等人[28]研究认为大多数树种花粉在10%蔗糖浓度下发芽最好的结论具有一定差异。在5%浓度处理下，板栗、日本栗和锥栗花粉在砂糖培养基上的萌发率最高，而茅栗在蔗糖培养基上的萌发率最高，体现了不同属、种间花粉萌发对能量物质需求的特异性。高温炎热干燥气候有利于栗属植物花粉的散粉和萌发，这是自然选择的结果。本研究基于对盛花期前后温度的模拟试验，发现在30～36 ℃高温下，栗属4种花粉均保持较高萌发率，其中中国原产种板栗、茅栗和锥栗花粉在33 ℃时萌发率达到最高，而引入种日本栗在30 ℃时达到最高，这与日本栗花期早于其它3种密切相关。栗属4种花粉萌发需要较长时间，培养36 h后萌发率均达最大值，其中在24 h以内萌发率迅速增加，超过24 h后萌发率变化不大，萌发数量明显减少，可以确定授粉后24 h内是各种栗属花粉萌发能力最强的阶段。花粉干燥可减少花粉含水量，降低新陈代谢，起到强制休眠的作用。研究表明，4种花粉干燥12 h萌发率达到最大，干燥24 h其花粉萌发率仍然保持在67%以上，超过24 h后萌发率快速下降，其主要原因是由于花粉过度失水所致。花粉的集体效应对于促进花粉萌发具有显著作用，栗属花粉属于典型的风媒花，体积小、质量轻而且数量多，花粉萌发具有依赖集体效应的天然优势。许清海等人[29]研究表明，大气中花粉浓度与板栗产量变化呈正相关。本试验证实栗属4种花粉萌发率均随花粉密度的增大而快速提高，当花粉密度达到550粒/视野时，各种花粉萌发率均在65%以上，因此在人工杂交育种时，要充分利用花粉集体效应的特点，通过增加花粉点授数量来提高杂交结实率。低温贮藏是种质离体保存的重点发展方向，也是花粉保存的主要方法。由于花粉活力受其基因型控制，不同物种花粉对各种贮藏条件的反应有着很大差异[30]，但总体认为低温有力于花粉的长期贮藏。本试验结果表明，－20 ℃低温是栗属花粉较为理想的贮藏温度，在此温度下各种花粉经数月保存后仍能保持较高萌发率，但要做到连年保存其效果不容乐观。0 ℃低温贮藏效果最差，主要原因是在该温度下花粉仍能进行呼吸代谢等生理活动，加剧了细胞衰老进程，导致花粉活力快速下降。－70 ℃低温效果好于0 ℃，但明显不及－20 ℃低温，贮藏30 d后萌发率均不到50%，并随贮藏时间延长快速下降。综合分析，－70℃贮藏效果不佳的原因应是多方面的，其一，受花粉含水量的影响。从已有相关研究结果来看，花粉含水量是影响花粉超低温保存的重要因子，含水量越高，冷冻时越容易形成冰晶，使细胞膜受损，加速花粉死亡。Rajasekharan等人[31]认为花药的自然干燥有助于保持最佳的花粉生活力。其二，受超低温保存过程的影响。花粉超低温保存程序复杂且专一性强，由花粉采集、干燥、密封包装、存放、解冻、应用等基本流程构成[20]，任何环节都会影响其活力。另外，不同种、属间花粉的生理差异，也是影响超低温保存效果的重要因素。因此，有针对性的研究花粉在低温、超低温保存前后的生理生化特征，以及解决超低温贮藏过程中的技术障碍，仍是今后栗属花粉种质长期保存的重要课题。

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