药用百合组织培养快繁技术研究

金亚征，俞凤芳，车瑞香，张荣梅 ，丁丽梅 ，方 华

（1.河北北方学院，河北 张家口 075000；2.廊坊市农业局，河北 廊坊 065000；3.河北省衡水市园林管理局，河北 衡水 053000；4.北京市农业广播电视学校顺义区分校，北京 101300）

药用百合属于百合科Liliaceae百合属LiliumL.植物，是集观赏、食用、药用为一体的多年生草本植物。其花美丽清雅，芳香宜人；其鳞茎是一种极具营养价值的保健品,具有很高的药用价值，可以活血祛瘀、消肿止痛、养血安神，养阴润肺止咳，还能治疗和预防糖尿病等疾病[1]。常规的百合繁殖方法为分球繁殖，因其存在繁殖系数低、种球数量有限、再次感染病毒的机率高等问题，远远不能满足药用百合商品化生产的需求。而利用组织培养技术进行繁殖，既能缩短繁殖周期，增加繁殖系数，又能减少病毒侵害机率。目前对食用和观赏性百合来说，以其鳞片、叶片、茎段、珠芽、花柱、子房和花丝等组织和器官作为外植体进行组织培养的研究均有报道[2-3]，其中以鳞片离体培养的繁殖效果最好，成功率最高，所以应用最为广泛[4-7]。文中利用药用百合鳞片作为外植体进行离体培养，研究了药用百合组织培养中鳞茎的诱导、增殖、生根等关键性技术问题，以求找到最佳的离体培养配方，大幅度提高繁殖系数，为药用百合的商品化快繁生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和地点

试验材料：药用百合的当年生子鳞茎。

试验地点：河北北方学院园艺组织培养研究中心。

1.2 研究方法

1.2.1 培养基

采用MS培养基，再添加不同种类、不同浓度配比的激素。

鳞茎诱导培养基：MS＋6-BA 0.2～1.0 mg·L-1＋NAA 0.2～0.8 mg·L-1。

增殖培养基：MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.2～1.0 mg·L-1，MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.2 ～ 1.0 mg·L-1。

生根培养基：1/2MS＋IAA 0.1～0.5 mg·L-1，1/2MS＋NAA 0.1～0.5 mg·L-1。

1.2.2 培养条件

培养温度为（25±2）℃，光照强度为1 000～2 000 lx，光照时间为每天12 h。

1.2.3 鳞茎的诱导培养

选择新鲜、洁白、无病斑的当年生子鳞茎（直径为1.5～2.0 cm），洗净泥土，剥取中间层鳞片作为试材。将鳞片用流动的清水洗净泥土，并冲洗5 h，再放入无菌操作室的超净工作台，用药物进行消毒处理，具体的处理方法[2]如下：将洗净的鳞片用75%的酒精浸泡40 s，用无菌水冲洗5 次，再用0.1%的升汞灭菌处理10 min，然后用无菌水冲洗5 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；小鳞片不进行切割处理，直接进行接种，且将小鳞茎的内侧朝上，成45°角插入培养基中，插入的深度为小鳞片的1/3～1/2。

激素配方采用NAA和6-BA的完全随机设计，共15个处理，处理1到处理15培养基BA的浓度分别是：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1，处理1到处理15培养基NAA的浓度分别是：0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.8、0.8、0.8、0.8、0.8 mg·L-1；每个处理设4 次重复，每个重复8瓶培养基，每瓶接入3个小鳞片。培养45 d后统计试验结果并按如下公式计算诱导率：

小鳞茎诱导率（%）＝分化鳞茎的鳞片总数／接种鳞片总数×100。

1.2.4 鳞茎的增殖培养

待诱导出的小鳞茎芽长到2.0～4.0 cm时，将其分为单株进行增殖培养。基本培养基为MS，激素配方采用BA和2,4-D；6-BA和NAA的完全随机设计，共10个处理，处理1到处理10的培养基里BA的浓度均为0.2 mg·L-1；处理1到处理5的培养基不加2,4-D，NAA的浓度分别为：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1；处理 6到处理10的培养基不加NAA，2,4-D的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1。每个处理4个重复，每个重复8瓶培养基，每瓶接入单株3株。然后在无菌条件下进行增殖试验，45 d后统计试验结果并按如下公式计算增殖率：

鳞茎增殖率（%）＝增殖的芽数/接种的总芽数×100。

1.2.5 鳞茎的生根培养

待增殖培养所得的鳞茎长至4.0 cm左右时，分成单株进行生根培养。基本培养基为1/2MS，激素配方采用IAA和NAA的完全随机设计，共10个处理，处理1到处理5的培养基不加NAA，IAA的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1；处理6到处理10的培养基不加IAA，NAA的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1。每个处理4个重复，每个重复8瓶培养基，每瓶接入单株3株。然后在无菌条件下进行生根培养，30 d后统计生根率。

结果调查：鳞茎生根率（%）=生根的株数/接种的总株数×100。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方对药用百合鳞茎诱导分化的影响

经观察，接种15 d后鳞片渐渐变绿，鳞片内侧分化出一些黄绿色的凸起，20 d后这些小凸起便分化成了小鳞茎，50 d后长出小叶，小鳞茎生长很快，60 d后可长成小苗。不同培养基配方对药用百合鳞茎诱导分化的影响如表1 所示。从表1可以看出，BA和NAA对药用百合鳞茎诱导有显著的促进作用，15种培养基均可诱导出鳞茎，经方差分析表明，配方10即MS＋1.0 mg·L-1BA＋0.5 mg·L-1NAA的诱导率显著高于其他处理，且诱导率达78.1%，每块鳞片的平均鳞茎数最多，达3.6个。图1显示了药用百合鳞茎诱导分化的情况。

2.2 不同培养基配方对药用百合鳞茎增殖的影响

待初代培养的鳞茎长到2.0～4.0 cm时，将其分为单株，移入表2所列培养基中，13 d后芽基部开始出现新生小芽，逐渐形成芽丛，45 d后统计试验结果。不同培养基配方对药用百合鳞茎增殖的影响如表2所示。从表2可以看出，BA加NAA或BA加2,4-D对药用百合小鳞茎增殖有显著促进作用，10种培养基均可增殖，经方差分析，配方3（MS＋0.2 mg·L-16-BA＋0.6 mg·L-1NAA）和配方7（MS＋0.2 mg·L-16-BA＋0.4 mg·L-12,4-D）的芽增殖率显著高于其他处理，且增殖率达到了90.6%和93.7%。图2显示了药用百合鳞茎的增殖情况。

表1 不同培养基配方对药用百合鳞茎诱导分化的影响†Table 1 Effect of different medium formulations on bulb induction and differentiation in medicinal lily

表2 不同培养基配方对药用百合鳞茎增殖的影响†Table 2 Effect of different medium formulations on bulb propagation in medicinal lily

图1 鳞茎诱导分化情况Fig.1 Bulb formation and differentiation status in medicinal lily

图2 鳞茎增殖情况Fig.2 bulblet proliferation status of medicinal lily

由表2还可以看出，在6-BA浓度不变的情况下，相同浓度的2，4-D较NAA更有利于小鳞茎的增殖，且增殖鳞茎的质量也好。故认为最适的鳞茎增殖培养基为7号。

2.3 不同培养基配方对药用百合鳞茎生根的影响

待增殖培养所得的鳞茎长至4.0 cm左右时，分成单株，接入生根培养基中，观察不同培养基配方对生根的影响，不同培养基配方对药用百合鳞茎生根的影响如表3所示。从表3可以看出：10种培养基配方的生根率均都很高，但根系生长情况不同，1/2MS＋0.1～0.5 mg·L-1IAA根系生长都很细弱，无根毛产生。1/2MS＋0.1～0.5 mg·L-1NAA，不但生根率高而且根系比较壮，大部分有根毛产生。配方7（1/2MS＋0.2 mg·L-1NAA）的生根效果最好，其平均生根数达6.3条，且根粗壮，根毛较多，适于移栽。总之，较高浓度的生长素不利于根的诱导，NAA诱导药用百合生根的平均时间较IAA短7.5 d左右，相同浓度的NAA较IAA更有利于根的诱导。图3、图4为药用百合根系的分化、生长情况。

表3 不同培养基配方对药用百合鳞茎生根的影响†Table 3 Effect of different medium formulations on bulb rooting in medicinal lily

图3 根系分化情况Fig.3 Root system differentiation status

图4 根系生长情况Fig.4 Root system growth status

3 结论与讨论

本试验结果1即试验一的配方10（MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.5 mg·L-1NAA）是药用百合最适宜的鳞茎诱导培养基配方。前人研究中所用的鳞片大都是成熟的鳞茎[8]，并经过低温处理解除休眠的，切取鳞片的中下部作为外植体[9]，本试验所用的外植体是从正在生长的植株上采集的当年生子鳞茎（直径约1.5～2.0 cm）上的小鳞片,不经过切块，直接插入培养基。这种方法省去了鳞茎低温处理过程，不用切割，操作简单，而且新生的子鳞茎非常干净，消毒容易。

本试验结果2即试验二的配方3（MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.5 mg·L-1）或试验二的配方7（MS ＋ 6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.4 mg·L-1）是药用百合鳞茎增殖最适宜的培养基配方。本试验结果与前人研究具有相似之处，即NAA和2,4-D对小鳞茎的增殖具有明显的促进作用,但随着浓度的不断升高，小鳞茎增殖率明显下降[10]。

本试验结果3即试验三的配方7（1/2MS＋NAA 0.2 mg·L-1）是药用百合芽生根的最适宜的培养基配方。与前人也有相似之处：一般的生根培养用1/2MS 培养基,并附加NAA[11]。本试验用1/2MS 培养基并附加NAA，诱导出的根短且粗壮，有根毛，移栽后易成活；而用1/2MS 培养基并附加IAA的培养基诱导出的根长且细弱，无根毛，移栽后成活率低，说明NAA诱导生根的效果要好于IAA。

综上所述，药用百合鳞茎诱导的最佳培养基配方是 MS＋6-BA1.0 mg·L-1＋ NAA0.5 mg·L-1；药用百合小鳞茎增殖最佳的培养基配方是MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ NAA 0.6 mg·L-1和 MS ＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.4 mg·L-1；药用百合小鳞茎生根的最佳的培养基配方是1/2MS＋NAA 0.2 mg·L-1。

参考文献：

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