杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用

王弦云，朱晓敏，王 勤，束庆龙，康向阳，吴山忠，周明善，张良富，曹翠萍

( 1.安徽农业大学 林学与园林学院，安徽 合肥 230036；2.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京100083；3.安徽省歙县特种经济林场，安徽 歙县 245900）

简单序列重复区间扩增多态性 (ISSRs: intersimple sequence repeats) 是 Zietkeiwitcz等人[1]于1994年发展起来的一种微卫星 (microsatellites或称简单序列重复SSRs：simple sequence repeats) DNA基础上的分子标记。其基本原理是，用锚定的微卫星 DNA 为引物，即在 SSR 序列的 3′ 端或 5′ 端加上2～4个随机核苷酸，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的 DNA 片段进行 PCR(polymerase chain reaction) 扩增。与其他分子标记技术相比，ISSR 分子标记技术具有多态性高、重复性好、成本低、操作简便、不需要预先知道靶序列信息等优点，在群体遗传多样性分析[2-4]、品种鉴定[5-6]、遗传图谱构建[7]等研究中已得到广泛应用。

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是杜仲科Eucommiaceae杜仲属EucommiaOliv. 雌雄异株落叶乔木，是我国特有的第三纪孑遗植物。杜仲在我国的分布区域很广，水平分布为北纬25°～35°，东经104°～119°，基本上位于长江中下游地区，即北自甘肃、陕西、山西，南至福建、广东、广西，东迄浙江，西抵四川、云南，中经安徽、湖北、湖南、江西、河南、贵州的十五个省区[8-9]。杜仲是我国名贵的药用植物，在我国首部药书《神农本草经》中就记载了杜仲树皮具有补肝肾、强筋骨、安胎、降压的功效。此外，杜仲全树的各种组织和器官都含有硬橡胶（又名杜仲胶），是制造电器特别是海底电缆必要的绝缘材料；其木材也是制作家具、农具和舟船的良好的原材料；同时，杜仲根系发达，抗性强，对土壤要求不严格，是绿化国土的首选树种之一。因此，种植杜仲具有良好的经济效益、生态效益和社会效益。

目前国内外对于杜仲的研究主要集中在杜仲的育苗、栽培和杜仲生物学、生理生化、化学成分分析及药理药效等方面。我国的科研工作者近年来开展了杜仲遗传学方面的研究，如杜仲染色体的诱导加倍[10-12]，一些分子标记技术在杜仲研究中也得到了应用，如 RAPD[13]和 AFLP[14]用于杜仲的性别鉴定，RAPD[15]、FLP[16]和 cpSSR[16]用于杜仲遗传多样性的研究，而有关ISSR应用于杜仲遗传多样性研究的报道尚鲜见。本研究旨在建立适合杜仲的 ISSR-PCR 反应体系，并筛选出具有多态性的有效引物，为进一步开展杜仲多居群的遗传多样性研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料采集于安徽省巢湖市庐江县汤池镇百花林场，选择30棵健康的杜仲植株，各样本的单株间距至少10 m，采集当年生的幼嫩叶片，分别编号并装入塑料袋中，带回实验室，置于-70 ℃的冰箱中保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

采用DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，德国）试剂盒和细胞破碎仪（TissueLyser II，德国）提取叶片基因组 DNA。将DNA在 0.8%的琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液下电泳，经EB染色后在紫外灯下拍照，杜仲基因组DNA如图1所示。利用微量分光光度计NanoDrop ND-1000检测到DNA的浓度为 70 ng·µL-1，纯度OD 值 (A260/A280) 约为1.8，然后将 DNA 放在-20 ℃ 的冰箱中保存以备用。

图1 杜仲基因组DNAFig.1 Genomic DNA in E. ulmoides

1.2.2 ISSR-PCR反应体系的建立

为了确定 ISSR-PCR 反应体系中模板DNA、dNTP、引物、Mg2+、Taq DNA聚合酶5个因素的最适反应浓度，采用5因素4水平的正交试验，结果如表1所示；然后通过对正交试验设计（如表2所示）中的16个反应体系分别进行测试和比较，找出扩增效果最好的因素组合，确定为最佳的反应体系。

实验用Trans2KTMPlus DNA Marker（北京全式金）作为分子量标准，其他试剂则购自生工生物工程上海有限公司 （Sangon）。选用加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物 （UBC Primer set # 9,University of British Columbia，Vancouver,Canada），由 Sangon公司合成。 正交试验所用引物为 UBC835，ISSR-PCR 反应总体积为 20.0 µL，包括表1和表2中的5个因素，此外每个反应体系中还需加入2.8 µL 10×PCR的缓冲液，总体积不足20.0 µL时，用HPLC超纯水补齐。在 BIORAD PCR 仪 (S1000TM Thermal Cycler) 中进行PCR 反应，扩增程序为：94 ℃，预变性5 min；36个循环：94 ℃，变性45 s，59.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；最后，72 ℃延伸7 min。PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶、100 V电压和 1×TAE的缓冲液条件下电泳30 min，经 EB 染色，紫外灯下拍照，检测扩增效果。将16个反应体系的结果相互比较，最后确定最佳的 ISSR-PCR 反应体系。

表1 杜仲ISSR-PCR反应体系正交试验的设计因素与水平†Table 1 Factors and levels of ISSR-PCR system of E. ulmoides in orthogonal design

表2 杜仲ISSR-PCR 反应的 L16 (45)正交试验设计Table 2 The orthogonal experimental design L16 (45) of ISSR-PCR of E. ulmoides

1.2.3 ISSR-PCR引物筛选

根据已建立的 ISSR-PCR 反应体系，对60条ISSR随机引物进行测试，从中筛选出条带清晰、位点多、多态性高且重复性好的引物，以用于分析杜仲的ISSR遗传多样性。

1.2.4 数据分析

对筛选出的引物的电泳图谱进行判读，每个位点上有条带的记为1，无条带的则记为0，获得由0和1组成的二元式矩阵，然后用POPGENE version 1.31软件计算多态性位点数N、多态性位点百分率PPL、等位基因观测数na、期望杂合度He[17]、有效等位基因数ne[18]及Shannon多态性信息指数I[19]等遗传多样性参数。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

对表2中的16个反应体系分别进行测试和比较，结果发现，反应体系11的扩增效果最好，其条带清晰，非特异性条带较少，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，拍照如图2。因此，将其确定为杜仲的最佳ISSR-PCR反应体系，其总体积为20.0 µL，具体包括 DNA (5 ～ 10 ng·µL-1) 2.0 µL、dNTP (10 mmol·L-1) 0.25 µL、引物 (10 µmol·L-1) 0.7µL、Mg2+(25 mmol·L-1) 2. 4 µL、Taq DNA 聚合酶(5 U·µL-1) 0.2 µL、10×PCR 缓冲液 2.8 µL、HPLC水 11.65 µL。

2.2 引物筛选

根据已建立的杜仲ISSR-PCR反应体系，从60条随机引物中筛选出了条带清晰、扩增位点多、多态性高且重复性好的引物14条。另外，引物的退火温度也影响了杜仲ISSR-PCR的扩增效果，引物不同，退火温度也可能不同。实验筛选出的引物名称及其序列和退火温度如表3所示。

2.3 遗传多样性分析

用已筛选出的上述14条引物，对所有实验样本进行ISSR-PCR扩增和遗传多样性分析，结果见表4。由表4可知，共扩增出108条谱带，扩增产物的大小介于250～3 000 bp之间，其中多态性位点数N为108，多态性位点百分率（PPL）为100%，观测等位基因数na为2.000，有效等位基因数ne为1.505，期望杂合度He为0.308，多态性信息指数I为0.472。

图2 杜仲ISSR-PCR正交试验设计反应体系11的琼脂糖凝胶电泳结果 (引物UBC835)Fig.2 Result of Agarose gel electrophoresis of reaction system 11 in ISSR-PCR orthogonal experimental design of E. ulmoides by using primer UBC835

表3 引物序列及其退火温度†Table 3 The primer sequences and annealing temperatures

表4 杜仲遗传多样性参数Table 4 Genetic diversity parameters in E. ulmoides

3 讨论与结论

影响PCR反应的因素有多种，其中DNA是PCR反应的模板，dNTP是 ISSR-PCR反应的原材料，引物与DNA靶序列结合引导PCR反应，Mg2+是Taq酶的激活剂，因此，实验中ISSR-PCR 反应体系受模板DNA、dNTP、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶等因素及因素间相互作用的影响，不同反应体系中各因素水平的组合不同，也就产生了不同的ISSR-PCR反应结果。为此，本实验采用正交试验找出了各因素水平间的最优组合，并确定其为最佳反应体系。

研究结果表明，杜仲的多态性位点百分率（PPL）为 100%，有效等位基因数ne为 1.505，期望杂合度He为 0.308，多态性信息指数I为0.472，基于同样的分子标记技术，与其他树种相比，其遗传多样性程度略高于雌雄异株的银杏[20](ne=1.43，He= 0.26，I= 0.39)，高于雌雄同株的白花泡桐[21](ne= 1.39，He= 0.24，I= 0.38)，这可能跟杜仲的生物学特性有一定的关系。因为杜仲是雌雄异株植物，其后代以种子繁殖为主，雌雄株间基因交流方式属于异交，因而增加了种群的遗传多样性，所以，杜仲的遗传多样性程度高于白花泡桐。由于本实验结果是仅基于一个群体的初步研究结果，杜仲群体的遗传多样性程度还有待于通过对多居群的研究进行评价。本研究从分子水平上揭示出杜仲具有较高的遗传多样性，表明 ISSR 分子标记技术适用于杜仲遗传多样性的研究，这为进一步研究杜仲多居群的遗传多样性奠定了理论和技术基础。

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