人源性治疗性抗体的应用与制备进展
2013-04-08郭夕源杨江华综述邬于川袁青审校
郭夕源,杨江华综述,邬于川,袁青审校
(1.泸州医学院免疫学教研室,四川泸州646000;2.泸州医学院附属口腔医院,四川泸州646000)
·综述·
人源性治疗性抗体的应用与制备进展
郭夕源1,杨江华2综述,邬于川1,袁青1审校
(1.泸州医学院免疫学教研室,四川泸州646000;2.泸州医学院附属口腔医院,四川泸州646000)
治疗性抗体在疾病的诊断和治疗方面具有重要意义。鼠源性单克隆抗体的临床应用受限于诱导产生人抗鼠抗体、亲和力低和半衰期短等,随着转基因小鼠和噬菌体展示技术的成熟,人源性治疗性抗体飞速发展,在肿瘤治疗、自身免疫性疾病的治疗、感染性疾病的治疗及减轻移植排斥反应、体内定位诊断、免疫调节等方面发挥重要作用。本文综述了治疗性抗体在肿瘤及免疫、移植等疾病中的治疗应用及人源性治疗性抗体的制备。
单克隆抗体;治疗性抗体;人源性
抗体(Antibody)具有多种生物学效应,其在疾病的诊断和治疗方面具有重要意义,尤其在疾病治疗方面巨大的应用前景,已经引起人们越来越多的关注。由于单克隆抗体[1]具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等特点,已被广泛应用于医学和生物学各领域,如肿瘤治疗、自身免疫性疾病的治疗、感染性疾病的治疗及减轻移植排斥反应、体内定位诊断、免疫调节等,这类抗体被统称为治疗性抗体。治疗性抗体的发展经历了曲折的百年历史。早在19世纪末,人们就发现抗血清能中和细菌毒素,于是用免疫动物的血清预防和治疗某些感染性疾病。从此,人们对治疗性抗体产生了浓厚的兴趣,但由于早期治疗效果不佳及严重的副作用,使得抗体治疗一直没有得到理想的效果。直到1975年Kohler和Milstein应用杂交瘤技术制备了鼠单克隆抗体,为人类树起了抗体研究领域的第一个里程碑。1982年,Levy等制备了针对一位B淋巴细胞瘤患者瘤细胞的独特性单抗,患者经此抗体治疗后,病情缓解,瘤体消失。1986年,Ortho开发了世界上首个用于治疗肾脏移植后的排斥反应的单抗药物:抗CD3单克隆抗体OKT3,该药获得了食品药物管理局(FDA)批准。1995年,用于治疗大肠癌的l7-1鼠单抗在欧洲上市。1997年FDA批准第一株人源化抗体上市。2002年,阿达利单抗(Adalimumab)成为第一个被美国FDA批准的治疗性人源单抗,随后一批人源抗体相继被开发[2-3]。1986-2012年,美国FDA或欧洲已批准了34个治疗性抗体上市。2012年3月,我国第一个治疗性人源化单克隆抗体尼妥珠单抗[4]临床应用研讨会在古巴举行。
1 治疗性抗体的应用
抗体既可作为受体的拮抗剂或抑制剂,起到中和毒素或阻断细胞因子对细胞的杀伤作用,也可利用其他的生物学效应,如抗体介导的细胞依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDCC)效应而发挥作用。另外抗体还可以作为靶向分子通过与放射性元素、化学药物及生物毒素分子耦联,通过靶向治疗发挥细胞毒作用。
自从首次发现单克隆抗体在医学可能存在的应用价值后,它们已被广泛地应用于诊断中,对其用于治疗的可能性研究正以指数级的速度推进。由1985-2008年进入临床研究的人类单克隆抗体的累计数[5]分析,人类单克隆抗体在临床应用中的研究快速增长,用于抗肿瘤和免疫调节的人类单克隆抗体开发率特别高。截止2011年,美国FDA批准的治疗性抗体广泛应用于治疗肿瘤、类风湿性关节炎、克罗恩病、抑制移植排斥反应、抗病毒预防等。
1.1 治疗性抗体在抗肿瘤方面的应用恶性肿瘤在临床上很难治愈。在手术、放疗和化疗不能取得最佳疗效的情况下,抗体被认为是治疗肿瘤的重要辅助手段。肿瘤治疗性抗体包括抗体、裸抗体和修饰的抗体。裸抗体主要通过ADCC效应聚集和活化宿主的效应细胞、通过CDCC效应、阻断受体-配体的相互作用以及诱导细胞凋亡等机制杀伤肿瘤细胞。修饰的抗体中部分抗体自身并不能杀伤肿瘤细胞,但可以运载放射性同位素、毒素、药物、酶等至肿瘤局部。将细胞毒性物质特异靶向于肿瘤细胞,使肿瘤局部达到高浓度,减轻全身应用带来的副作用及由此导致的剂量限制。肿瘤治疗性抗体与传统的生物药物和化疗药物相比,具有良好的靶向、可以诱导机体自身产生针对疾病的抵抗力、疗效好、毒副作用低,而且可以反复给药。现已批准上市的治疗性抗体中肿瘤治疗性抗体占35.48%,包括用于治疗淋巴瘤的单抗Rituximab、Tositumomab、Ibritumomab。治疗白血病的单抗Gemtuzumab、Alemtuzumab、Ofatumumab[6];治疗乳腺癌的单抗Trastuzumab,治疗大肠癌的单抗Cetuximab、Bevacizu-mab、Panitumumab[7]和治疗黑色素瘤的单Ipilimumab[8]。其中Ibritumomab适用于治疗复发或难治性低度、滤泡性以及转移性B细胞非霍奇金淋巴瘤,是第一个肿瘤放免治疗剂;结直肠癌治疗药Panitumumab与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)具有高亲和性,现已用于治疗实体肿瘤进入临床试验阶段,这也是第一个完全人源性的单克隆抗体。尼妥珠单抗Nimotuzumab可特异性封闭EGFR[4,9],使肿瘤细胞对电离辐射敏感,因其提高放疗敏感性而提高放疗效果。
1.2 治疗性抗体在自身免疫性疾病中的应用治疗性抗体在多种自身免疫性疾病的治疗中取得了许多研究成果。这些抗体主要包括细胞因子特异性抗体和淋巴细胞特异性抗体。该抗体可与细胞因子特异性结合,切断信号通路,从而起到阻断细胞因子对细胞的杀伤作用。已批准的治疗性抗体中治疗自身免疫性疾病的抗体占32.26%,包括治疗克罗恩病的单抗Infliximab和Certolizumab;治疗类风湿性关节炎的单抗Adalimumab、Golimumab和Tocilizumab;治疗银屑病的单抗Efalizumab和Ustekinumab;治疗哮喘的单抗Omalizumab[10];治疗多发性硬化症的单抗Natalizumab;通过噬菌体展示技术与剑桥抗体技术所识别的针对B-淋巴细胞刺激因子的治疗系统性红斑狼疮的人源性单抗Belimumab[11]。其中Infliximab的治疗适应证不仅局限于克罗恩病,还包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎等自身免疫性疾病;Uste-kinumab被批准用于治疗中度至重度斑块型银屑病,并已证明在克罗恩病和银屑病关节炎的疗效[12]。其在研究细胞表面标志、提纯可溶性抗原、进一步研究抗体的结构和功能等方面都起着十分重要的作用;Omalizumab能抑制免疫球蛋白IgE与高亲和性IgE受体在肥大细胞和嗜碱细胞表面结合,从而阻止过敏反应介质的释放、发展成治疗严重哮喘的重要选项[13]。Belimumab经过多年研究在2011年3月被FDA批准用于治疗狼疮,这是FDA在56年来第一个批准的狼疮治疗新药。
1.3 治疗性抗体在感染性疾病和其他疾病中的应用抗体治疗微生物感染可以通过多种机制发挥作用,如阻止微生物粘附、聚集、中和病毒、中和毒素等,也可以通过抗体的效应功能如ADCC或CDCC效应发挥作用。抗体既可以直接作用于病原体本身,也可以中和其产生的毒性物质,还可以增强宿主细胞的效应功能。治疗性抗体对细菌感染的治疗主要针对临床的常见耐药菌株,如金黄色葡萄球菌等。对一些病毒性疾病效果较好,如抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒感染、炭疽杆菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及脓血症等方面。另外,治疗性抗体在其他疾病中也有所应用,如防止血块形成的单抗Abciximab、治疗恶性腹水的单抗Catu-maxomab[14]、治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿的单抗Eculizumab、防骨质流失的单抗Denosumab等。
2 全人源治疗性抗体的制备
在临床应用早期,OKT3和l7-1这两种鼠源性单克隆抗体均引起了由于产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse anti-body,HAMA)而导致的不良反应。20世纪90年代初,抗内毒素单抗在用于治疗脓毒症时,不仅没有取得预期的效果,反而增加了患者的死亡率。这使人们认识到鼠单抗药物在人体治疗中存在诸多问题。鼠源性的单抗由于存在异源性在人体内可诱导HAMA产生,而且鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应,加之在人体内的半衰期短,从而限制了其应用。
1997年后,人源化抗体陆续上市。近年批准上市的抗体几乎都是基因工程重组嵌合、人源化或全人源性抗体。人源化抗体较好地保留了亲本抗体的特征,在人体的半衰期和效应功能也更加接近于人抗体。但由于其仍至少具有10%的异源蛋白,仍旧具有免疫原性[15],在临床应用中还是受到不同程度的限制,据报道,已上市的嵌合抗体或人源化抗体仍然存在人抗嵌合抗体(Human anti-chimeric antibody,HACA)或人抗人抗体(Human anti-human antibody,HAHA)[16-17]。为彻底解决抗体的免疫原性问题,目前人们更多将目光转向发展全人源性抗体。
随着基因工程抗体时代的到来,多聚酶链式反应(PCR)技术的发展、大肠杆菌内分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功获得和噬菌体抗体库技术的产生使全人源性抗体的产生得以实现。2002年,第一个全人源性抗体Humira上市。全人源性抗体可以通过多种技术来制备,目前使用最多的制备技术主要是转基因小鼠技术和抗体库技术。
2.1 转基因小鼠技术1989年,Bruggemann等成功将人抗体重链基因库转入小鼠,使小鼠产生了人重链蛋白的免疫应答。随后,转基因小鼠技术不断发展完善。1994年,美国转基因小鼠作为生产全人抗体的载体问世。1997年Abgenix公司使用该技术成功地制备了转基因小鼠Xenomouse,这种Xenomouse是一种经过遗传工程变异的小鼠,其体内能够合成具有人类蛋白质序列的抗体。Medarex公司建立的转基因鼠称为HuMAb-Mouse,其所研制的抗体已进入Ⅲ期临床试验阶段[18]。转基因小鼠技术用于制备全人源性抗体时,由于抗体是体内产生,经历正常装配和成熟过程,所以具有功效高、靶亲和力强的优点。但也存在一些缺陷,除了操作复杂、难度高、费用巨大以及产生不完全的人序列外,英国学者Clark认为,由于在小鼠体内完成抗体的装配和糖基化的最后步骤,所以产生的抗体可能会具有鼠糖基化的模式。虽然目前尚无临床证据表明,鼠糖基化会引起任何问题,但是直接导致这些单克隆抗体最终并不是全人源性的。
2.2 噬菌体抗体库技术20世纪90年代,组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术。抗体库技术的产生使人们改变了传统的抗体制备方法,开辟了体外制备抗体的新天地,目前被认为是制备人源性抗体的最快速、简单和经济的方法。抗体库最大的特点是除了可以进行高通量筛选和所筛选到的抗体是人源性抗体外,还在于它的库容量可以达到109~1013,理论上可以从这些大容量人抗体库中筛选到针对任何抗原的特异性抗体[19],解决了一些针对弱免疫原、毒性抗原的难制备抗体的问题。噬茵体抗体库根据抗体基因序列的来源,可分为天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库、合成抗体库四类。抗体库技术具有强大的筛选功能,利用噬菌体抗体库可以直接从库中筛选针对某一抗原的特异性抗体。以噬菌体抗体与抗原的结合为基础,通过多轮“吸附一洗涤一洗脱一扩增”过程,可使特异的噬菌体得到上千倍乃至109的富集。传统筛选方法可分为固相淘筛法和液相筛选法;新近一些筛选方法如完整细胞筛选法、组织或体内筛选法、选择感染法、高通量筛选法等[20-21]。针对不同抗原,其最佳筛选方法的选择也不相同。根据各筛选方法不同的特点,可选用两种进行交替筛选来提高筛选阳性率。但若要从天然抗体文库中筛选到专一针对各种抗原的抗体,那么文库容量需足够大,至少要大于109[22]。纵观近年研究报道,所构建的大多数人源抗体文库所用的淋巴细胞RNA来源比较单一,一般来自健康志愿者或针对某种疾病构建抗体文库,以至于抗体文库的多样性受到一定的局限[23-24]。近些年有许多其他展示平台系统也被用来进行抗体库的展示,包括核糖体展示、酵母展示、细菌展示、杆状病毒展示、哺乳细胞展示、反转录病毒展示以及细菌周质展示,还有最小单位的展示系统,如mRNA展示、DNA展示系统等等。核糖体展示技术使展示技术摆脱了体内展示技术对转化效率的限制,库容量大大提高,为体外高通量的筛选奠定了技术;mRNA展示技术直接将mRNA同表达的蛋白质连结,使筛选的效率进一步提高;DNA展示技术DNA模板取代不稳定的mRNA使展示系统更加的稳定,方法简便巧妙。三种技术已在抗体的筛选、亲和力成熟、分子进化方面广泛的应用。上述一些体外展示技术不依赖于任何细胞体系,不受克隆和细胞转化效率的影响,库容量大,可达1013~1015,可弥补传统的体内展示技术的不足。
3 展望
人源性单克隆抗体是一类快速增长的有前途的定向治疗药物[25]。随着科技的进步,在20世纪90年代,人类对分子层面的研究深入,尤其是转基因小鼠和酵母或噬菌体展示技术,重建了在人类单克隆抗体的发展的兴趣。治疗性抗体是进入临床研究中增长最快的类别,其本着制备便捷、高靶点特异性、疗效好、毒副作用小、应用范围广、开发空间阔的优势保持重要的地位和迅猛的发展势头。由于在临床使用上独特的优势和各种相关技术的日益成熟,在过去的10年里,上市的单克隆抗体成倍地增长[26],但是单克隆抗体药物还面临一些问题,主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面,鼠源性的单抗可能被宿主的免疫系统攻击,产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,嵌合性抗体和人源化抗体虽可解决鼠源化问题但是也会产生人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)。此外,肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性,肿瘤细胞的抗原性调变等也可能影响耦联物的疗效。药理学方面的问题主要是由于耦联物是异体蛋白,会被网状内皮系统摄取,有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓,因而细胞剂量不足。大分子的耦联物通过毛细血管内皮层及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。今后人们将致力于解决这两方面的问题。从已上市的抗体药物看,未来治疗性抗体将朝着全人源化、微型化、规模化及智能化方向发展。但全人源性抗体是否能解决非人源聚糖具有潜在的免疫原性所引起的效价降低及给患者带来的严重后果,还有待于临床检验。随着生产单抗的新方法不断出现,人们将开发出各种性能优良抗体、多功能抗体融合蛋白及抗体替代物,抗体类药物的疗效将大大提高。
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1003—6350(2013)01—0107—04
10.3969/j.issn.1003-6350.2013.01.0050
2012-09-11)
国家自然科学基金(编号:31000415);四川省卫生厅资助项目(编号:80167);四川省青年基金(编号:2012JQ0018)
邬于川。E-mail:wuyu6807@tom.com