大肠杆菌溯源技术研究进展

赵宏，赵化冰，曲鹏，李宗梦，李君文

（1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.中国人民武装警察部队后勤学院，天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津 300162；3.中国人民解放军军事医学科学院卫生学与环境医学研究所，天津 300050）

大肠杆菌是人和温血动物肠道中的正常栖居菌。通常情况下，大肠杆菌对人类是无致病性的。但是某些情况下，大肠杆菌中的致病性菌株侵入人体一些部位时，就会对人类健康产生严重威胁。

近些年由致病性大肠杆菌导致的全球食品污染事件频发，从人们熟知的、肆虐全球20 年的大肠杆菌O157 ∶H7 以及去年于德国爆发的大肠杆菌O104 ∶H4均对人类健康以及经济贸易造成了重大损失。尽管人们已经研发出了多种针对致病性大肠杆菌某些血清型的快速、灵敏的检测技术，使得目标菌在较短时间内被准确检出。但是在致病微生物的溯源领域仍然缺乏有效技术。刚刚过去的德国大肠杆菌疫情让世界认识到了有效的追溯体系对于避免大肠杆菌疫情再次上演至关重要。因此建立有效的微生物追溯方法、简便高效的追溯技术将改变公共卫生突发事件的处置模式，极大提高工作效率。

因此，国内外的科研工作者试图用各种技术来实现包括致病性大肠杆菌在内细菌溯源问题，取得了一定的进展。本文对于细菌溯源技术及在大肠杆菌研究中的进展进行了介绍。

“微生物溯源”一词最先由Hagedorn 和Wiggins 提出。微生物溯源是指通过比较污染样品和可能污染源中的微生物的差异或其他生物标记的有无来判断两者之间的联系，进而确定污染来源[1-3]。

目前，人们对于检测比较污染样品和可能污染源中的微生物差异的方法主要可以分为两类：生物化学方法（即表型方法）和分子方法。

生物化学方法（即表型方法）是以微生物基因产物——各种酶的生化反应为基础，来判定微生物种类。常用的生物化学方法包括抗生素耐药性分析法（antibiotic resistance analysis）和碳源利用法（carbon source utilization）。这两种方法在实际检测时都需要对大肠杆菌进行选择性培养并建立数据库才能完成细菌源的追踪分析。分子方法是基于细菌的遗传物质即DNA 为研究对象的。通过建立细菌个体的“DNA 指纹”，将分离于污染物的细菌样本与可能的污染来源分离得到同类细菌样本DNA 指纹进行比对分析，从而得到污染来源。生化方法花费低，操作简单，不依赖于大型分析仪器、适合日常大批量样本分析的特点使之在基层应用比较普及。但从本质说，生物化学方法是基于细菌表型的鉴定方法，其结果容易因菌体生活状态及培养条件的改变而产生变化，鉴定结果不够稳定，这是生化方法的不足；分子方法是基于细菌的遗传物质的差异，是通过分析菌株特定的基因位点或染色体组的多态性差异鉴定菌株种类，因此更加可靠稳定，更加适合细菌溯源研究。

目前主要的细菌溯源的分子方法主要包括：脉冲场凝胶电泳法（PFGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、肠杆菌基因间重复一致序列的聚合酶链式反应（ERIC-PCR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、单核苷酸多态性（SNP）分析、细菌的核糖体基因分型（ribotyping）、多位点序列分析（MLST）等。

1 脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）

1984 年，Schwartz 和Cantor 首先提出了脉冲电泳法，原理是将经过凝胶的连续电场改为脉冲电场，这就使百万兆基大小的DNA 片段以特定的大小尺寸进行分离，同时使得片段的分析精确性更高。现已证实PFGE 方法的鉴别能力相当高，在大肠杆菌的研究领域中占有很大优势。PFGE 现在被广泛用于致病微生物的分型[4]，被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”[5]。目前，美国FDA 已经建成了基于PFGE 的致病微生物检测网络，即PulseNet。美国PulseNet 网络依托各地州监测实验室，通过分离的病原细菌DNA“指纹图谱”分析（主要利用脉冲场凝胶电泳技术）以及网络化信息交流平台，发现传染病的跨地区和国际间传播，开展传染病暴发流行的调查、追踪、溯源，已经成功发现、处置和预警了多起食源性传染病暴发疫情。目前国际PulseNet 已经拓展到众多区域，组成了包括加拿大PulseNet、欧洲PulseNet、亚太区PulseNet、拉丁美洲PulseNet、中亚PulseNet 在内的国际化网络。该网络也已经成为世界卫生组织以及国际公共卫生机构获取信息和应对公共卫生事件的重要依据。国际PulseNet 涉及的传染病病原体包括产毒性大肠杆菌O157、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌等。

理论上，所有的细菌都能通过PFGE 进行分型分类。PFGE 在细菌溯源研究中的应用是基于菌株的DNA 指纹原理来确定菌株之间的亲缘关系。在食源性病原体溯源研究中，对分离出的菌株进行脉冲场凝胶电泳处理，依据Tenover 等（1995）[6]提出的有关菌株同源性判别标准判断菌株之间的相关性，对协助追踪感染来源起到了重要作用。Bono JL，Smith TP 等对于STEC O157 的来源进行研究，利用PFGE 对426 个分离株进行分析，结果揭示了STEC O157 存在762 个基因组多态性，可分成175 个型。该研究发现在8 个主要STEC O157 谱系中，有7 个来源于牛，揭示了PFGE 对于流病菌株内部亲近菌株的进化关系分析具有优势[7]。

2 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）

RFLP 是最早被使用的分子标记技术，它反映了DNA 分子不同酶切位点的分布情况。其原理是DNA序列碱基的改变能够引起限制性内切酶位点的产生或消失，限制性内切酶对不同个体的DNA 序列处理后所产生的片段长度不同，通过凝胶电泳区分出不同的条带，与DNA 探针进行Southern 杂交和放射自显影后便可获得能反映出个体特性的RFLP 图谱。RFLP 标记不受标记位点数目的限制，共显性好，结果很稳定，适合用于构建遗传连锁图谱。Ho PL，Lo WU 等利用对大肠杆菌中CTX-M 编码质粒进行包括RFLP 在内的分析，以鉴定分离株是来源于动物粪便、人粪或人尿中，研究表明在IncFII group 的大肠杆菌菌株的CTX-M-14 编码质粒具有不同的来源[8]。

3 肠杆菌基因间重复一致序列的聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）

ERIC（enterobacterial repetitive intergenic consensus）是Sharples 等首先在大肠杆菌中发现的一种肠杆菌基因间共有重复序列[9]。其中心存在高度保守的、长约44 bp 的核心序列。不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，可进行指纹图谱分析。原理是利用根据ERIC 核心序列设计的反向引物进行PCR 扩增，扩增产物大小在50 bp～3 000 bp 之间，根据所得数目不等、大小不同的各自独特的电泳带型来达到菌株分型的目的。ERIC-PCR 技术不仅可以用于含ERIC 序列的细菌的分类与鉴定还可进行菌株亲缘关系鉴定等研究[10-15]。DuanH，ChaiT 等利用ERIC-PCR 对于猪舍气溶胶中的大肠杆菌来源进行分析。他分别对猪舍舍内、上风处及下风处等6 个点进行菌株收集。实验证明35.1%的气溶胶大肠杆菌来源于猪的粪便[16]。

4 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP 是由1992 年荷兰科学家Zabeau 和Vos 所创造[17]，其原理是将RFLP 和RAPD 相结合，用内切酶切割基因组DNA 获得不同长度的片段，用特定的接头使这些DNA 片段的两端连接，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR 引物3′末端的识别进行PCR 扩增，最后通过聚丙烯酰胺电泳使这些特异的限制性片段分离。AFLP 结合了RFLP 和RAPD 两种技术的优点，使标记方法既具有RFLP 的可靠性，又具有RAPD 的灵敏性。此方法操作简单、成本较低、省去了制备探针和分子杂交的过程、多态信息含量丰富，是目前一种有效的分子标记。AFLP 是第一代分子标记，在基因定位、连锁图谱的构建等方面应用较多。目前AFLP 在大肠杆菌来源追溯上的应用研究较少，查到的有Leung KT，Mackereth R 等利用AFLP 技术对110株不同寄主来源的大肠杆菌分离株进行溯源与致病力的研究，发现AFLP 在检测大肠杆菌寄主来源及致病性方面具有很高效率。对寄主识别率在90%以上，对于非致病大肠杆菌与肠致病性，VT 细胞毒素型的区分率也在90%以上[18]。Guan S，Xu R，Chen S 等也利用AFLP 对105 株不同来源的寄主粪便中分离得到的大肠杆菌进行来源追溯，发现94%牲畜分离株，97%野生动物分离株，97% 人分离株被准确追溯，AFLP 与multiple-antibiotic-resistance（MAR）和16SrRNA 相比，具有更高效率[19]。

5 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）

SNP 是第三代分子标记技术，它是指基因组上的单个核苷酸发生变异而引起的多态性，SNP 所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP 并不包括后两种情况。转换和颠换的比例大概为2 ∶1。SNP是二等位基因多态，也叫做双等位基因标记（biallelic marker），有时也会有3 个和4 个等位基因多态性存在，但这很罕见。由于二等位多态性是非此即彼的选择，往往只分析＋/－即可，有利于进行基因分型和自动化筛选[20]。SNP 分布十分广泛，几乎在所有的已知或未知基因附近都能找到一系列的标记位点[21-22]，在人体中，每一千个碱基当中就会发生一个SNP[23]，而在其他的哺乳类动物的基因组中也很可能含有两到三百万个SNP。早期研究证实，在获得更加丰富的SNPs 基础上可以大大增加对大肠杆菌进行分型的能力。因此大肠杆菌SNPs 位点研究逐渐成为热点。2005 年，Florence Hommais 利用MLST 技术研究大肠杆菌SNP位点以及基于SNPs 的进化关系[24]。2006 年，张唯等利用STEC O157：H7 全基因组测序芯片筛查获得了可观的SNPs，在523 染色体组基因中共发现906 个不同的SNPs。由此并制作了STEC O157：H7 染色体SNP 结构图，进而以此对STEC O157：H7 的起源做了研究[25]。

因此SNP 所独有的数量多、分布广泛、适于快速、规模化筛查、易于基因分型的特性决定了它更适合于对细菌不同地域性进行溯源识别，在食品安全相关的细菌溯源研究具有巨大潜力。本课题组对多个国家进口的食品中大肠杆菌分离株进行了基于持家基因SNP研究，发现了适于溯源的特异性地理标记，显示了SNP技术具备地理溯源能力。

6 细菌的核糖体基因分型（ribotyping）

核糖体分型技术是RFLP-Southern 印记技术的一种，所使用的探针是根据16S 和23SrRNA 序列设计，大大减少了杂交后图谱所包含条带的数量，非常易于分析。但是这一特点也限制了这一技术应用于相关性较近的菌株间的鉴别。

核糖体分型利用细菌核糖体RNA 都含有高度保守的“持家基因”特性，核糖体RNA 基因存在于所有细菌中并且在遗传上高度保守，所有细菌在染色体不同位点上都有多个核糖体基因操纵子，针对该保守序列设计探针，与之杂交，可以观察核糖体RNA 基因在整个基因组分布的多态性。具体方法是将基因组DNA 进行酶切消化并用电泳进行分离，然后采用针对核糖体持家基因设计的特异性探针进行杂交，记录探针的杂交状况，从而得到核糖体RNA 基因分布图。美国Dupont 公司全自动微生物核糖体基因分型系统（RiboPrinter microbial characterization system）的推出，使得RT 分型方法实现了自动化和标准化，这是其在分子分型中应用的优势。利用这套系统对细菌进行核糖体分型，可在8 h 内获得结果，该方法可在短时间内对大量致病菌进行分析，结果重复性较高。Wu J，Rees P，Dorner S.对于Blackstone River 分水岭上部的大肠杆菌的密度以及来源通过ribotyping 进行研究。对于大肠杆菌来源的研究结果分析，利用ribotyping 可以确定在居住区大部分大肠杆菌来源于人，而在开阔地和丛林则主要来源于野生动物[26]。

7 多位点序列分析（Multilocussequencetyping，MLST）

多位点测序分型（MLST）技术是近些年才发展起来的分子生物学分析方法，它结合了高通量的序列测定和生物信息学的方法，具有较高的分辨率。它针对持家基因设计引物进行PCR 扩增和测序，根据得出的每株病原体各个座位等位基因数目进行等位基因图谱或序列类型鉴定以及聚类分析。该技术快速简便，重复性好，分辨率较高，数据标准，可实现实验室间数据共享及比较[27]。该技术被用于许多致病微生物的进化研究。Andrew R.Dodgson 等应用MIST 方法对不同地理区域收集的107 株临床光滑念珠菌菌株及2 个参考菌株进行指纹图谱分析，对11 个持家基因编码区进行扩增并测序分析，其中有6 个基因的扩增片段具有多态性位点，81 个核苷酸位点发现有变异。在109 株菌中鉴定出了30 个序列型（STs），在所有分离株中有5 个主要的分支，其中3 个进化分支显示明显的地理差异，表明在不同的地理区域，光滑念珠菌具有明显的遗传分化[28]。

Maxim S.Sheludchenko，Flavia Huygens 通过MLST数据库分析，运用生物信息学分析软件根据大肠杆菌MLST 数据库数据为基础，确定以大肠杆菌6 个管家基因中的8 个高分辨率的SNP 位点组合为标记，使用等位基因特异性实时荧光PCR 技术（AS-qPCR）对于澳大利亚昆士兰东南地区环境粪便样本分离得到的114 株大肠杆菌进行溯源分析。结果将114 株大肠杆菌划分为50 个不同的SNP profiles，并且还发现了一些寄主特异性的SNP profiles，这其中就包括人源特异的SNP profiles[29]。这在该课题组随后的研究中利用6个人源SNP profiles 对昆士兰东南地区Coomera River 进行了为期2 年的研究。证明了人源特有的SNPprofiles 存在，并以此做了人为活动对水源的影响研究[30]。但该技术在管家基因不存在或仅存在低水平变异的病原株中分辨率较低，而且系统进化树图不一定能反映其间的系统发生关系。

综上所述，在大肠杆菌溯源研究中多种分子生物学技术和方法都被尝试应用。这些技术各有优劣，运用得当会在食品安全监管、公共卫生、疾病预防以及口岸健康监控、食品安全等领域发挥应有作用。上述技术也许还不能完全概括现今研究的全部，但是笔者认为这些技术可能在未来的细菌溯源研究领域中继续使用，尤其是在致病性大肠杆菌追溯体系中占有一席之地，只是所占比例有所不同。在这些技术中，SNP及MLST 技术将是未来主要方向。受到人类基因组计划的推动，人类对于大肠杆菌基因组结构及功能已经清晰掌握，并可能运用强大的生物信息学手段找到适合各种溯源要求的标记。SNP 的另一个迷人之处在于它的检测易于自动化、高通量，所以一旦发现可用于溯源的标记，大肠杆菌的溯源就变得简单易行了。同时，SNP 技术结合了MLST 的开放数据平台，借助eBURST 分析可以为研究大肠杆菌群体遗传关系，分析大肠杆菌地域间遗传多样性提供强大支持。因此，我们相信日新月异的分子生物学技术必然会促进大肠杆菌溯源技术的不断进步，使大肠杆菌的行踪在人类掌握之下，从而使人类能更好地预防因致病性大肠杆菌导致的食源性疾病。

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