胶体金免疫层析技术在食源性致病菌快速检测中的应用

李 宏 付冠艳 付淑君 钟菲菲

刘 佩2 曾 林2 杨丽霞2

（1.中国合格评定国家认可中心，北京 100062；2.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013）

世界卫生组织（WHO）统计报告［1］表明，食源性疾病的实际发病数要比报告的病例数多300～500倍，全世界因食物污染而致病者已达数亿。发展中国家常见的食源性疾病包括霍乱、大肠杆菌感染、沙门氏菌病、志贺氏菌病等。中国疾病预防控制中心资料［2，3］显示，近10年来，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别占17.9%，8.9%，5.6%，是最常见和最主要的病因物质。2000～2005年湖南省共发生食物中毒325起，中毒8 998人，死亡85人。中毒场所以家庭发生最多，占总中毒起数的45%，中毒人数以集体食堂最多，中毒原因中以化学性和生物性食物中毒发生起数最高，占总发生起数的45%［4］。因此，建立一种便捷、快速、准确的检测技术，对于避免食源性致病菌污染，降低中毒事件的发生率具有重要意义。

目前食源性致病菌的检测仍以传统方法为主，细菌分离、培养及生化鉴定耗时长、操作繁琐、环境及主观因素影响较 大［5］；生 化 鉴 定 法［6］和 PCR 法［7，8］等 不 仅 需 要 昂 贵 的 设备，还需要较高的技术要求和资金投入，制约了在现场快速检测中的应用。胶体金免疫层析技术是在20世纪80年代初发展起来的，具有简单、快速、廉价、适应性广等优点［9－11］，可在基层单位进行各种食源性致病菌的快速筛查。胶体金免疫试纸条作为一种简单快速的检测技术，无需洗涤，不需要贵重仪器设备，且特异性强、灵敏度高、稳定性好、可单份测定，全过程只需15min左右，结果易于判断，成为目前生物快速检测的主要方法之一。

1 胶体金免疫层析技术

1.1 胶体金免疫层析原理

胶体金免疫层析技术将金标技术、免疫技术和层析技术相结合，是一种固相标记免疫技术［12］。其原理是在硝酸纤维素膜的某一区段固定特异性抗体，把该硝酸纤维素膜一端浸入样品溶液后，由于毛细管作用，样品将向该膜的另一端移动，当移动到固定有抗体的区段时，样品中相应的抗原即与该抗体特异性结合，该区域便呈现一定的颜色，从而实现特异性免疫检验［13］，该法通常有双抗体夹心和竞争法两种形式。

1.2 操作步骤

1.2.1 胶体金的制备 胶体金又称金溶胶，是金盐被还原成金后形成的金颗粒悬液，它具有一般溶胶的特性［14］。胶体金溶液的制备方法有化学还原法、电化学还原法、高分子保护法、反胶团法等［15］，最经典的还是1973年Frens建立的柠檬酸还原法［16］，目前该法仍然是制备纳米金的首选［17］。

1.2.2 胶体金标记蛋白质 胶体金标记蛋白质反应的机制至今仍无确切结论。一般认为：由于胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，二者通过静电作用相结合［18］。也有人提出不同的观点，Oliver［19］认为胶体金不仅展示了静电荷特性，同时也展示了疏水特性，胶体金粒子的表面存在带负电荷的疏水性基团，可与待标记蛋白通过疏水相互作用结合。标记前用K2CO3调节胶体金的pH值［20］至略大于蛋白等电点［21］0.5个pH 单位，这时蛋白质呈电中性［22］，不会因为静电引力而聚集。胶体金标记蛋白最重要的是选择合适的pH值和抗体（抗原）的用量，沉淀用含少量稳定剂的溶液悬浮［23］即可。

1.2.3 胶体金试纸条的制备 胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜（NC）、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等［24］，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中NC膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用。周文达等［25］通过化学法证明活化后的NC膜可大大提高检测稳定性和灵敏度。

将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定量的包被抗原（抗体）和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次固定于PVC板，即成试纸条［26］。试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封保存。密封的测试条室温下一般可保存6～18个月。

2 在食源性致病菌快速检测中的应用

2.1 沙门氏菌的检测

沙门氏菌是食源性疾病中最常见的病原菌，2003～2005年中国食源性疾病中沙门氏菌占微生物的17.2%，排在第2位［27］。美国疾病控制和预防中心数据显示：在1997年大约有30万个肠炎沙门氏菌感染引起的病例，传染源多为鸡蛋［28］。Seo等［28］用免疫层析试纸条检测纯培养和鸡蛋中的沙门氏菌，得到最低检测限分别为1×107，1×108CFU／mL；陈琼等［29］用自制的沙门氏菌胶体金试纸条最低可检测2.3×105CFU／mL。

2.2 大肠杆菌O157的检测

在食源性病原微生物中，肠出血性大肠杆菌占有重要地位，其主要包括 O157：H7、O26：H11和 O111，O157：H7是出血性肠炎的主要致病菌［30－32］。1982年，O157：H7在美国被发现，此后在世界各地散发或地方流行。1996年在日本大阪地区发生O157：H7流行，患者逾万，死亡11人。2001年在中国江苏、安徽等地发生了多次食源性感染O157：H7事件，导致177人死亡［13］。王静等［33］用胶体金法检测奶粉、面粉、淀粉等样品中的大肠杆菌O157，得到最低检测限为1×105CFU／mL；黄岭芳等［34］用此法检测牛肉、莴苣等样品中的大肠杆菌O157，得到最低检测限为1×104CFU／mL。

2.3 单核细胞增生李斯特菌的检测

单核细胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患疾病，它是某些食物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能引起败血症、脑膜炎和单核细胞增多，导致严重食物中毒，病死率高达30%～70%［35］。崔焕忠等［36］利用原核表达系统表达致病性李斯特菌特异性蛋白－肌动蛋白聚合蛋白（actin polymerizing protein，ActA），制备单增李斯特菌特异性抗体，研制出该菌的胶体金检测试纸，蔬菜、牛奶中的最低检出限为3.9×105CFU／mL。

2.4 金黄色葡萄球菌的检测

金黄色葡萄球菌在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因而食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性难题，在美国由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，在加拿大则占到45%［37］。目前，在金黄色葡萄球菌诊断方面，Hoover等［38］利用生化方法准确地鉴定出此菌；Rall等［39］利用PCR法进一步找出了其肠毒素基因，这些方法虽然精确、敏感，但需要精密仪器设备，费时且成本高，目前难以在基层单位推广应用，胶体金检测法让这些难题有了解决的方向。刘洪贵等［40］通过自制多克隆抗体，制备免疫胶体金来检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，灵敏度可达1×104CFU／mL；Su－Hua Huang等［41］利用金黄色葡萄球菌的一种代谢产物是蛋白A的特性，通过在纳米金表面标记抗蛋白A的IgG制备试纸条，检测猪肉、牛肉中的金黄色葡萄球菌，灵敏度高达25CFU／g。

2.5 猪链球菌的检测

猪链球菌是革兰氏阳性菌，在自然界中分布广泛，可引起猪的败血性和局灶性淋巴结化脓性病症，能通过受伤的皮肤和黏膜感染人［42，43］，引起人的脑膜炎、败血症、心内膜炎，极少数可以造成永久性失聪［44－46］。Ying Ju等［47］通过自制抗猪链球菌的多克隆抗体来制备胶体金试纸条，检测灵敏度可达1×106CFU／mL。

3 展望

目前，胶体金免疫试纸条在食源性致病菌检测领域还没有中国国产成型的产品，仍处于实验室研究阶段，进一步提高检测灵敏度、实现多元检测及现场定量检测是未来发展的方向。由于致病菌种类繁多，同种致病菌又存在多个亚种，这使得如何获得高特异性抗体成为胶体金免疫试纸法成功的关键和难点，探索致病菌在体内的受体可为高特异性抗体的获得提供研究方向。

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