伪狂犬病毒载体的研究进展

彭芸芸 仲晓宁 李春蕾 （山东省烟台市动物疫病预防与控制中心 264003）

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病毒(PRV)引起的急性传染病，每年给养猪业造成巨大的经济损失[1]。基因工程疫苗对该病的预防起到了十分重要的作用，通过基因工程技术使PRV中的毒力基因失活，但病毒粒子仍然保持较好的抗原性。重组病毒粒子作载体同目的基因一起在动物体内表达不仅十分安全，还可以做到一针多防，提高生产效率，在新型动物病毒载体中已显示出了良好的应用前景。本文就伪狂犬病毒载体研究进展作一综述。

1 猪伪狂犬病毒基因组结构

猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科中的猪疱疹病毒Ⅰ型。病毒基因组为线状双链DNA，长度为150kb，C+G含量约为74%，由长独特区(UL)和短独特区(US)，以及US两侧的重复序列(TRS)与内部重复序列(IRS)所组成。US和UL区段，含有至少70个基因，可编码70～100种蛋白质，成熟的病毒粒子只含有约50种蛋白质[2]。

在PRV中已发现11种糖蛋白，分别命名为gB(gⅡ)、gc(gⅢ)、gD(gp50)、gE、gG(gX)、gH、gI(gp63)、gK、gL、gM和gN，它们已被定位和测序[3]。病毒增殖的必需的糖蛋白主要有gB、gD、gH、gL、gK；非必需糖蛋白是决定毒力因素的因子，主要有gE、gI、gG、gC、gM、gN等，除gG外均为成熟病毒粒子的结构成分，gG常存在于感染细胞分泌物中[4]。

2 伪狂犬病毒表达载体的优越性

基因组庞大，含有多个复制非必需区，其容量可高达40Kb，可在其感染的细胞中忠实的进行修饰，外源基因的表达产物可以诱导机体产生持续时间较长的体液与细胞免疫反应。除此之外，伪狂犬病毒的宿主范围较大，能感染多种动物和野生动物，这就为一苗多用打下了很好的基础。最为重要的是在重组伪狂犬病毒中所表达的蛋白质可以进行翻译后加工、修饰，其中许多过程与体内相类似，因此表达产物具有天然蛋白质的活性，并且保留了其相应的抗原性、免疫原性及功能。

3 重组伪狂犬病毒的构建

3.1 构建原理 重组伪狂犬病毒的构建应分两部分进行：第一步是构建重组质粒。此质粒应含有启动子，下游接表达的外源基因，有时为筛选方便，还要插入有启动子标记的基因如LacZ等，它们的两侧是伪狂犬病毒特异的DNA同源序列；第二步是将重组质粒导入伪狂犬病毒感染的细胞中，伪狂犬病毒DNA与重组质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组，从而将外源基因装到伪狂犬病毒基因组的特定部位，构建出重组病毒。

3.2 筛选方法 目前最常用的方法是通过化学底物及颜色变化等来筛选重组病毒，即插入报告基因法，将β-半乳糖苷酶(LacZ)基因或者抗生素基因等与外源基因同时导入伪狂犬病毒基因组中，通过在培养液中加入Xgal、G418等试剂来筛选重组病毒。

3.3 外源基因的表达调控结构 目前，构建重组伪狂犬病毒所选用的主要是gG、gE启动子，因其结构独特且活性较强。一般说来，启动子序列距外源基因起始密码子越近时表达效果越好。

3.4 构建重组病毒注意事项 复制非必需区TK、gG、gE基因是目前应用较多的同源序列。再者，还必须做好亲本病毒株的选择，它应该是目前常规使用的疫苗株，从而才能够不引起宿主发病；再就是考虑其亲本株的宿主特异性，以对其它动物不构成威胁为前提。最后还要考虑到它所诱导的保护性免疫应答的类型，是全身性免疫应答还是局部的黏膜免疫应答。

4 猪伪狂犬病毒载体的研究进展

4.1 PRV载体的构建 目前，PRV基因缺失疫苗株常常是通过缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，缺失分为单基因缺失和多基因缺失。（1）第1代基因缺失疫苗株。第1代基因缺失疫苗是指缺失PRV TK基因的疫苗， 世界上第1个获得批准使用的基因弱毒疫苗就是伪狂犬的TK缺失疫苗株BUK2dl3[5]，该病毒株通过基因工程技术在TK基因引入缺失，在细胞培养上不能回复为TK+，对猪不仅没有毒力而且具有较好的免疫原性。（2）第2代基因缺失疫苗株。第2代基因缺失疫苗以缺失TK基因为基础，进而缺失编码非必需糖蛋白gE、gI、gG、gC等基因，使该疫苗免疫的动物不能产生相应的抗体，有利于通过血清学方法区分强毒感染猪和疫苗免疫猪，这也是其最显著的特点，因此该种疫苗又被称为标记疫苗[6]，从而为净化和根除伪狂犬病提供了有力的工具。TK-/gC-疫苗株：1987年KitS等[7]报道在PRVBUK2d13株的基础上通过缺失gC基因SaII片段的1100bp构建出了缺失TK、gC基因的PRVdlgC/dlTK株。TK-/gE-疫苗株：该疫苗株是从NIA23和NIA24发展而来的。首先将无毒株NIA24株基因组的HindIII片断与野毒株NIA23基因组的被引入缺失HindⅢB片断共转染PK22细胞，病变后，空斑筛选病毒，然后将其基因组与一个TK基因的EcoRI位点引入有EcoRI接头的质粒共转染PK22细胞，在BrdU存在下筛选在TK基因含有EcoRI位点的重组病毒。将此重组病毒的基因组用EcoRI完全酶切后共转染PK22细胞，即得到重组病毒TK-/gE-即“783”[8]。

在国内，郭万柱教授率先系统地开展了伪狂犬病病毒(PRV)分子生物学研究[9]，首次构建了PRVFa株TK基因缺失株，PRVFagI-/gI-基因缺失株，PRVFagI-/gI-/LacZ+基因缺失株，又将构建的PP63lacZ转移载体质粒与PRVFa DNA经磷酸钙转染，在MDBK细胞内同源重组获得PRVFagE-/gI-/TK-/LacZ+三基因缺失疫苗株(PRV2SA 215)，PRV2SA215是我国首次成功研制出的FagE-/gI-/TK-/LacZ+三基因缺失疫苗株，填补了我国在这一领域的空缺。

4.2 外源基因在载体中的表达 徐高原[10]构建了表达乙型脑炎病毒NS1基因的重组PRVTK-/gG-/LacZ+/NS1株，经检测，重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白，该重组病毒有望作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗。范伟兴等[11]在PRV疫苗Bartha株的TK基因中插入增强绿色荧光蛋白(EGFP)的整个表达盒，又将猪瘟病毒的E2基因插入到EGFP基因的多克隆位点区，经BUDR筛选到了融合表达EGFP和CSFVE2基因的重组病毒TKPRVrGE2，免疫接种试验在猪体内可以产生抗PRV和CS2FV的抗体。QianP等[12]将gG启动子控制下的口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因插入PRV基因组中的gG基因的N端下游，得到重组病毒PRV2VP1。周国辉[13]选择呈gE-表型的PRV经典弱毒疫苗Bartha2K61株为载体，构建了表达H3N2亚型SIVHA基因的重组PRV。罗燕等[14]成功地构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒-伪狂犬重组病毒，为研制猪细小病毒-伪狂犬病重组疫苗创造了条件。这些工作极大地推动了伪狂犬病毒在基因工程载体方面的研究。

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[14]罗燕, 郭万柱, 徐志文等.含绿色荧光蛋白基因的猪细小病病毒-伪狂犬病毒重组病毒的构建[J].畜牧兽医学报, 2005, 36(10): 1064-1068.