地中海贫血骨髓移植中造血干细胞状态及功能的研究

李续娥 ，李 峰

(华南师范大学生命科学学院，广东广州510631)

地中海贫血(简称地贫，thalassemia)是世界上常见的遗传性血液病之一. 其分子基础为珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍，使形成血红蛋白四聚体的α－链/非α－链比例失衡，进而引起红细胞破坏而溶血［1］.1925年，Thomas Cooley 和Pear Lee首次对这种发生在意大利儿童的严重贫血进行了描述.因为早期的病例均来自于地中海地区，故称为地中海贫血或海洋性贫血.以后逐渐发现这种疾病还发生在东南亚、美国黑人、印度次大陆，我国长江以南各省区的发病率也较高，特别是广东、广西更为常见［2］.

1 地中海贫血骨髓移植的预处理方案及危险等级

1.1 骨髓移植是治愈地贫的唯一方法

地中海贫血是一种进展性疾病，目前通过规律输血和使用除铁剂来提高生活质量和延长生存期，但英国的调查报告显示:地贫患儿从10 岁开始，生存期出现恒定的下降，有50%以上的患者在35 岁前死亡，主要的原因是静脉输注去铁胺(desferrioxamine)的顺应性太差. 目前虽然有2个新的口服除铁剂(去铁酮deferiprone 和地拉罗司deferasirox)已经使用于临床，但其长期的疗效有待进一步证实.对于一个终身输血的地贫患者，即使采用严格的除铁治疗，亦只能大体上减少而未能根除铁的过载.经过了20 多年的研究，实验和临床的资料显示，地贫的基因治疗可能引起许多不良反应. 尽管在动物实验有所进展，但进入临床应用尚无时刻表［3］.

自Thomas 和他的同事于1982年首先报道了第一例成功的人类白细胞抗原相合同胞骨髓移植治疗地贫病例以来，异基因造血干细胞移植(即骨髓移植)开始被用于治愈地贫.至今，骨髓移植仍被认为是治愈地贫的唯一方法. 我国大陆地贫病人骨髓移植起步较晚，总例数目前约300 多例，主要分布在南方医科大学南方医院、中山大学附属第二医院等广州几家大医院中.

1.2 地贫骨髓移植的预处理方案及危险等级

地贫骨髓移植预处理的目的是根除异常造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和建立耐受环境以利正常HSCs 的生存和发育. 全身放疗可以同时达到这2个目的，但在白血病等的治疗中发现其能导致生长滞后和二次肿瘤发生率增多，使全身放疗的应用受到了限制，特别对于具有较长生命期的年幼者.白消安(Bu)及其衍生物在治疗非恶性血液病和先天性代谢病方面有相当多的经验.Bu 对骨髓－红系轴最原始的前体具有优良特异性. 骨髓致死剂量的Bu 对淋巴系统毒性很小，几乎不引起免疫抑制.环磷酰胺(Cy)在再生障碍性贫血异基因骨髓移植治疗中具有保障植入的适当免疫抑制作用，Cy 200 mg/kg 分4 天使用，能使白血病骨髓移植恒定植入.因此，至今大多数移植中心地贫移植预处理仍然以Bu/Cy 为基础［3］.

对预处理方案完全相同的年龄小于17 岁的161 例地贫骨髓移植治疗效果进行多元回归分析，发现肝肿大超过2 cm、肝脏纤维化和不正规使用去铁胺为3个危险因素，显著地降低了移植后的生存率.正规去铁胺使用被定义为开始输血后18个月内使用和皮下注射8～10 h 每周至少5 次. 这样可将地贫患者分成3个危险等级:Ⅰ级，3个危险因素均没有;Ⅱ级，有1～2个危险因素;Ⅲ级，3个危险因素均有［4］.

按照意大利Pesaro 的经验，Ⅰ级、Ⅱ级患者使用14 mg/kg 的Bu 及200 mg/kg 的Cy 处理，而Ⅲ级患者使用低剂量的Cy(120～160 mg/kg). ISSARAGRISIL［5］总结了其在泰国26 例地贫骨髓移植的经验，发现14 mg/kg 的Bu 可以引发40%的排斥风险，而20 mg/kg 的Bu 可显著降低排斥风险.FANG等［6］使用20 mg/kg 的Bu 配合马法兰(Melph)与噻替哌(T T)亦使7 名患者中的6 名获得移植的成功.SLAVIN 等以氟达拉滨(fludarabine)和抗淋巴细胞球蛋白强效的免疫抑制剂为基础的半量Bu 非清髓性预处理方案，治疗了一组包括地中海贫血在内的非恶性血液病，取得了较好的效果［7］. 近十多年，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、羟基脲(hydroxyurea)、硫唑嘌呤(azathioprine)和氟达拉滨(fludarabine)也被适当加入到Bu/Cy 方案中，以增加高风险患者的无病生存率和降低移植相关死亡率.

2 HSCs 状态和功能的研究

作者在探讨红景天苷(Salidroside，SD)是否通过激活与DNA 修复相关的Parp－1 酶活性而维持小鼠HSCs 的实验中，对HSCs 的状态及功能进行了详细的研究［8］，首先发现腹腔注射SD(75 μg/g)几乎能完全消除H2O2(0.25 μmol/g)引起的小鼠(WT C57BL/6)骨髓中CD34－Flt3－LSK(Lin－c-kit+Sca-1+)细胞(即长期HSCs)数量的减少;改用CD150+CD48－LSK 免疫分型法检测，亦得到同样的结果.接着，将上述处理小鼠(CD45.2+)的1 000个LSK 细胞与1 ×106来自Boy J 小鼠(CD45.1+)的骨髓细胞(缺乏c-kit+)混合后移植到致死剂量放射处理的Boy J 受体小鼠，4个月后检测供体CD45.2+细胞在受体外周血及骨髓LSK 群中的数量，发现SD 能显著增加移植细胞造血功能的竞争重建;取第1 次移植4个月后的受体骨髓细胞进行第2 次移植，得知SD 亦能明显增强移植细胞的长期造血重建功能.

为了确定SD 在氧化应力下维持HSCs 数量及造血重建功能的原因，我们测定了其对H2O2处理小鼠的骨髓CD34－LSK 细胞群凋亡的影响，并未看到SD 阻止细胞凋亡的发生.通过Pyronin Y 和Hoechst 33342 染色RNA 和DNA 检测了CD34－LSK细胞群中静止期(G0)的细胞数量，通过5－ 溴－2 脱氧尿核苷(BrdU)标记检测了CD34－LSK 细胞群中DNA 合成期的细胞数量，发现SD 能消除氧化应力引起的HSCs 进入细胞周期的作用.

SD 的抗氧化作用是否与清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)有关?用彗星实验检测了H2O2处理小鼠骨髓中新鲜分得的Lin－细胞的DNA损伤情况，用Western－blot 检测了DNA 损伤相关的表达物组蛋白γ－H2AX 和8－羟基脱氧鸟苷(8－oxodG)，发现和四羟甲基季(4－苯甲酸)卟啉锰(Ⅲ)(manganese (Ⅲ)tetrakis (4－benzoic acid)porphyrin，MnTBAP)和N－ 乙酰半胱氨酸(N－ acetyl－L－cysteine，NAC)一样，SD 能明显消除H2O2引起的DNA 损伤.但采用荧光探针(CM-H2 DCFDA)检测骨髓CD34－LSK 细胞群的ROS，发现SD 与MnTBAP、NAC 不同，不能消除H2O2引起的ROS 增加.对骨髓中的单核细胞经SD、MnTBAP 和NAC 处理2 h，再经H2O2处理2 h，检测随后0、2、4、8、12 h其8－oxodG 的表达，发现:SD 能在氧化处理4 h 后开始降低8－oxodG 的表达，在12 h 几乎无8－oxodG的表达;而MnTBAP、NAC 在各时间点上均减少了8－oxodG 的表达;彗星实验亦显示了同样的DNA修复动力学.说明与MnTBAP、NAC 不同，SD 的抗氧化作用机理与ROS 清除无关.

为了明确SD 在氧化应力下对HSCs 维持的作用机理，作者选择了5 种缺乏不同DNA 修复途径的小鼠Brca2－/－、DNA－PKcs3A/3A、Xpc－/－、Fancd2－/－以及Parp－1－/－进行了彗星实验及8－oxodG 表达检测，发现SD 只对H2O2引起的Parp－1－/－(缺少编码PARP－1 酶基因)小鼠的Lin－细胞的DNA 损伤的修复无作用;同样，SD 只对H2O2处理的Parp－1－/－小鼠骨髓中LSK 细胞PARP－1 酶活性无增加作用;用PAR、PARP－1 抗体进行的免疫共沉淀实验亦得到同样的结果. 说明SD 抗氧化作用需要通过PARP－1 酶的参与. 进一步比较SD 对H2O2处理的Parp－1+/+和Parp－1－/－小鼠骨髓中CD34－LSK 细胞G0期的影响，以及SD 与8－羟基－2－甲基喹唑啉酮(PARP－1 酶活性抑制剂)对H2O2处理的这2 种小鼠的共同作用，均发现SD 通过激活PARP－1 酶活性增加HSCs 在G0期的数量. 另外，将Parp－1+/+和Parp－1－/－小鼠骨髓中LSK 细胞移植到致死剂量照射的受体小鼠4月后，发现SD需要激活PARP－1 酶活性方可明显减少H2O2引起的供体CD34－LSK 细胞进入细胞循环的数量;将上述SD 和H2O2处理后的一次移植受体小鼠的骨髓细胞再二次移植到致死剂量照射的受体小鼠4月后，显示，SD 同样需要激活PARP－1 酶活性方能增加供体细胞在受体中的长期造血重构功能.表明SD的确通过激活与DNA 修复相关的PARP－1 酶活性发挥其抗氧化作用，以维持HSCs 的数量和造血重构功能.

在另一研究中［9］，为了确定白细胞介素－3 受体α(IL－3Rα)在干细胞CD34+CD38－中的过量表达就是范可尼贫血急性髓性白血病(FA AML)的干细胞特征，作者将正常人的CD34+细胞、FA AML 病人的CD34+IL－3Rα+和CD34+IL－3Rα－细胞异种移植到亚致死量照射的NSG/SGM3 (NOD scid IL－2rγ－/－/SCF，GM－CSF and IL－3)小鼠，6 周后发现正常人的CD34+细胞、FA AML 病人的CD34+IL－3Rα+细胞能够成功移植，而且正常人CD34+细胞移植后不表达IL－3Rα，FA AML 病人CD34+细胞移植后表达IL－3Rα. 为了观察白血病的发展又进行了二次移植，接受FA AML 病人CD34+IL－3Rα+细胞移植的9 只小鼠在移植后的15 周内均发展为白血病，接受其他2 种细胞移植的小鼠在移植后4个月内均无白血病的特征出现.进一步的实验表明，IL－3Rα 在正常人的CD34+CD38－干细胞中是不表达的，而在FA AML 的CD34+CD38－干细胞中高度表达.说明IL－3Rα 的过表达是FA AML 干细胞的特有标志.

我们已有的研究包括了HSCs 的状态(数量、在细胞周期的分布、活性氧的状态、凋亡情况、DNA 损伤程度、DNA 损伤相关酶活性)和功能(同种和异种一次移植和二次移植后受体小鼠体内造血重建功能)的内容.而地贫HSCs 的研究只涉及其移植前后的动脉机能失调与血液循环中的CD133+VEGFR2+和CD34+VEGFR2+细胞的增殖关系、原有的血液高凝集状态的改善、HSCs 中CD34+细胞的磷酸化蛋白质组学分析等［10－13］，未见关于地贫HSCs 状态及功能的研究.

3 地中海贫血骨髓移植与HSCs 研究相结合的发展趋势

3.1 根据预处理过程中HSCs 的根除情况调整预处理方案是临床发展的趋势

地贫移植排斥是移植的一个重要问题.移植后残留的宿主干细胞百分比可以作为患者移植排斥的预测因子.当宿主干细胞的残留超过25%时几乎所有的患者发生移植排斥;宿主干细胞的残留介于10%～25%时，排斥的风险是41%;当宿主干细胞的残留少于10%时仅有13%的患者发生排斥［14－15］.可见在骨髓移植预处理过程中对宿主干细胞根除情况的检测，能提高临床骨髓移植治疗地贫的成功率，是未来地贫进行骨髓移植治疗的发展趋势.

通过分析不同地贫患者预处理过程中其HSCs的状态(数量、在细胞周期的分布、活性氧的状态、凋亡情况、DNA 损伤程度、DNA 损伤相关酶活性)和功能(体外的集落检测、NOD/SCID 小鼠体内造血重建功能)，实时了解残留宿主HSCs 的情况，判断预处理是否达到根除异常HSCs 的目的，为现有骨髓移植预处理方案的调整提供科学指导.

3.2 用HSCs 状态与功能评价地贫患者骨髓移植危险等级是未来的趋势

重型地中海贫血患者病情程度与移植前预处理方案及移植效果密切相关，如前所述，目前临床上通常采用意大利Pesaro 评分标准对病情程度进行分级.但Pesaro 评分标准中肝脏肿大的评价指标比较粗糙，肝脏纤维化评价需通过创伤性的活检穿刺才能进行.考虑到地贫患者的肝脾肿大、骨骼重构是由于红系的迅速分化，造成骨髓极度增生，并进行性扩展到通常骨髓细胞不存在的髓内和髓外区域的结果，因此可以尝试用骨髓的状态评价地贫移植的危险等级.沈君等［16］对27 例拟行骨髓移植的重型地中海贫血患儿的股骨骨髓进行磁共振成像(MRI)检查，发现地中海贫血患者，由于骨髓无效造血、髓内溶血，引起了红骨髓增生，MRI 上表现为黄骨髓逆转为具有造血能力的红骨髓;另一方面，由于反复输血、肠道的铁被过分吸收，骨髓内亦出现铁沉积信号.认为MRI 上股骨近段红骨髓面积百分比可作为重型地中海贫血骨髓移植病情分类的一个独立危险因素.

众所周知，人出生后造血细胞主要存在于红骨髓中，红骨髓是主要的造血器官，因此用地贫患者的HSCs 状态和功能评价其骨髓移植的危险等级显得更直接、更客观. 随着流式细胞技术的快速发展、HSCs 表面抗原的不断揭示及其抗体的应用，地贫患者骨髓或外周血中的HSCs 研究已可实现.因此，对不同地贫患者预处理前HSCs 的状态和功能进行检测，通过与现有的地贫移植危险因素和危险分级比对分析，提出一种用地贫患者HSCs 状态及功能来评价其骨髓移植危险因素和等级的方法，客观、方便地指导地贫骨髓移植是未来发展的趋势.

广东地区β－地贫基因携带率为2.54%［17］，约有患者3 000 人.在中国，1 名重型地中海贫血患者，如果接受正规输血及去铁治疗，每年的费用在5 万元以上［18］.开展地中海贫血骨髓移植中HSCs 状态及功能的研究，直接、客观地评价地贫骨髓移植的危险因素和危险分级，实时了解异常HSCs 的根除情况，为现有骨髓移植预处理方案的调整提供科学指导，最终可提高临床骨髓移植治疗地贫的成功率.

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