地毯草黄单胞菌ABB－2对红掌防御相关生化指标的影响

李淑彬 ，方 茂，林晓云，钟秀芳

(华南师范大学生命科学学院，广东广州510631)

红掌(Anthurium andraeanum)为世界热带、亚热带地区广泛栽培的著名切花和盆栽观赏花卉［1］. 红掌生长喜阴、喜温热. 在这种条件下，极易发生微生物感染而引起侵染性病害.其中，由地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)引起的细菌性叶斑病(Bacterial blight)是红掌的致命病害［1－4］.该病害最早于1960年在巴西发现［2］.目前世界上所有红掌种植地区均有该病害. 我国自90年代引种栽培以来，在广东、云南、海南等红掌主栽省份也相继报道该病发生，一些重病区发病率高达100%［4］.由于红掌植物对目前使用的化学杀菌剂特别是含铜制剂极为敏感，而细菌性叶斑病菌对大多数抗生素有很强抗性［1－4］，对该植物病害尚无有效的防治药物和防治措施，该病的发生是制约红掌产业发展最重要因素.抗病品种的选育和种植是目前唯一有效的防治措施.

研究植物在病菌侵染后寄主防御相关生理、生化的动态变化是了解病原菌与寄主相互作用生化机制、提高植物抗病品种选育中选择准确性和育种效率的基础.目前，相关研究在多种经济作物和果蔬植物如水稻［5］、玉米［6］、白菜［7］、香蕉［8］、芒果［9］、番茄［10］等已有大量报道.对红掌植物在病菌侵染下防御体系的动态变化报道尚少［11－12］.

本论文报道一株新近分离的地毯草黄单胞菌ABB－2(X. axonopodis ABB－2)对红掌主栽品种“阿拉巴马”(Alabamb)的致病性，并对该病菌侵染后红掌防御相关主要生化指标的动态变化进行了研究，以期为了解红掌与寄主相互作用生化机制、选育抗病品种提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试菌株及菌悬液接种物制备

X.axonopodis ABB－2 由本实验室从广州某红掌种植基地细菌性叶斑病红掌典型病株叶片分离、鉴定并保藏. 保藏的X. axonopodis ABB－2 转接到新鲜牛肉膏蛋白胨斜面，于30 ℃培养箱中培养48 h后用无菌蒸馏水将斜面上X.axonopodis ABB－2 细胞洗下，并用无菌蒸馏水稀释到OD600=0.6(X.axonopodis ABB－2 细胞数大约为每mL 108菌落形成单位(CFU/mL).

1.2 供试红掌及栽培管理

健康、生长一致的红掌主栽品种“阿拉巴马”(Alabamb)从广州某红掌种植基地购买，立即单株移栽到塑料盆中，移栽基质为m(泥炭土)∶m(沙土)=3∶1，移栽前基质121 ℃灭菌1 h.每7 d 施用营养液(m(N)、m(P)、m(K)=20∶10∶20)1 次，每3 d 浇水1 次. 温室的空气相对湿度为80%～85%、温度(28 ±4)℃，适应培养7 d 后于华南师范大学兰花中心温室中开始实验.

1.3 X.axonopodis ABB－2 对红掌致病性研究

1.3.1 离体叶片感染试验 取健康红掌植株叶片先用自来水冲洗表面杂物及灰尘，用无菌解剖刀片将叶片切成约6 cm2，放入无菌培养皿中(预先加入适量无菌水保持湿度)玻璃支架上. 将配好的病菌悬液(1 mL)均匀喷洒到叶片表面.无菌水处理作为正常对照，置于28 ℃、昼夜光照时间12 h/12 h 的恒温光照培养箱内培养. 定期观察叶片状况，统计12个重复接种叶片的病叶率(病叶数/12 ×100%).

1.3.2 盆栽感染实验 每株红掌挑选3～4 片大小一致的叶片.于每一选择的叶片正面均匀喷洒3 mL新鲜配好的菌悬液，接种后移入试验温棚，用保鲜袋套袋3 d 后移去保鲜袋.按照1.2 方法进行管理.共计接种6 盆植株22个叶片. 定期观察植株生长状况，统计每一植株的病叶数目并计算接种叶片的病叶率(病叶数/植株接种叶片数×100%)及总病叶率(病叶数/植株总叶片数×100%).

1.4 病菌X. axonopodis ABB 诱导寄主防御相关生化指标测定

1.4.1 病菌接种及样品制备 按照1.3.2 的方法每株挑选2 片大小一致的叶片，用X. axonopodis ABB 接种.接种后第0、2、4、6、8、10、12、14、16 天，剪取未接种的叶片，用蒸馏水清洗干净、滤纸吸干水后剪去叶片主脉. 参照王学奎的方法［13］，准确称取0.5 g 叶片置于预冷的研钵中，加入4 mL 预冷的0.1 mol/L pH 8.8 硼酸缓冲液(含1 mmol/L 的EDTANa2)以及少量的石英砂和聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成均浆，移至离心管中，再用2 mL 的提取缓冲液冲洗残留部分后合并，4 ℃、11 000 r/m 离心20 min，上清液即用于分析.每个测定3个重复.

1.4.2 防御相关生化指标的测定 可溶性蛋白含量采用考马氏亮蓝染色法测定［14］，以牛血清蛋白作标准曲线，计算蛋白质含量，单位为每g 鲜重中蛋白质的mg;超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照王学奎的方法［13］，以抑制50%NBT 光化还原为1个酶活单位(U);过氧化物酶(POD)活性测定参照王学奎的方法［13］，以愈创木酚－30% H2O2为底物测定，每分钟OD 值变化0.01 为1个POD 酶活单位(U);多酚氧化酶(PPO)活性测定参照王学奎的方法［13］，以邻苯二酚为底物测定，每分钟OD 值变化0.01 为1个POD 酶活单位(U);苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照李合生的方法［15］，以L－苯丙氨酸为底物测定，以每小时内OD290变化0.01 为1个酶活性单位(U);游离酚含量参照罗晓芳等采用Folin 酚还原法测定［16］，以没食子酸作为标准样品建立总酚含量标准曲线. 样品中游离酚含量用每g鲜组织所含没食子酸的质量(mg)表示(mg/g).

2 结果与分析

2.1 X.axonopodis ABB－2 对红掌的致病性

在离体叶片试验中，红掌叶片在X. axonopodis ABB－2 接种2～3 d 后，细菌性叶斑病叶部感染的典型症状—水渍状病斑开始出现，在第4 天，所有接种的叶片均出现病斑，病叶率达到100%(表1).随着离体叶片培养时间延长，病斑面积不断扩大，病斑颜色加深逐渐成灰褐色，在感染第10 天后几乎整个叶片呈茶褐色腐烂(图1). 盆栽感染实验显示了与离体叶片感染实验一致的结果.该病菌接种3～4 d后，被接种叶片背面出现水渍状病斑，随着感染时间的延长病斑逐渐扩展、中心颜色转变为黑褐色.从接种后第8 天开始，所有接种的叶片均出现病斑，接种叶片的病叶率达到100%. 且未直接接种叶片也开始出现病斑，在第16 d 植株中65%以上的叶片出现病斑.显示X. axonopodis ABB－2 对红掌“阿拉巴马”具有较强的致病性.

表1 X.axonopodis ABB－2 接种红掌后病叶的发生率Table 1 Percentages of leaves with lesion of A. andraenum cultivar‘Alabamb’after inoculation with X. axonopodis ABB－2

图1 X.axonopodis ABB－2 对红掌“阿拉巴马”的致病性Figure 1 Pathogenicity of X.axonopodis ABB－2 on A.andraenum cultivar‘Alabamb’

2.2 X. axonopodis ABB－2 对红掌可溶性蛋白含量的影响

在X.axonopodis ABB－2 感染后，红掌叶片可溶性蛋白含量在首先的12 d 内有一个持续而缓慢的增加(图2)，在接种后的第12 天，其可溶性蛋白含量相比非接种对照所有测试的平均值增加了21.76%.随后逐渐下降，第16 天的含量仍然显著高于非接种对照(P ＜0.01).

图2 X.axonopodis ABB－2 诱导红掌可溶性蛋白含量的动态变化Figure 2 Changes in soluble protein content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

2.3 X. axonopodis ABB－2 对红掌SOD、POD、PPO 和PAL 活性的影响

在X.axonopodis ABB 接种后前一阶段，红掌叶片SOD 活性快速增加，侵染后第4 d 达到峰值，较非接种对照SOD 活性测定的平均值增加了15.37%;随后急剧而持续的下降，至测试周期结束时(病菌接种后的第16 d)，其活性仅为非接种对照的55.46%(图3A).

X.axonopodis 接种后，红掌叶片POD 活性呈现于其SOD 活性相似的动态变化(图3B). 该病菌接种后的0～6 d，红掌叶片POD 活性逐渐增加，在第6天达到活性峰值，较非接种对照平均值增加了36.62%，随后缓慢持续下降，在第12 天其活性下降到与非接种对照接近. 而在测试周期结束时(病菌接种后的第16 天)，POD 活性下降到仅为非接种对照73.36%的水平.

X.axonopodis 接种同样诱导了PPO 活性的升高，其活性峰值出现在该病菌感染后的第8 天，其较非接种对照平均值增加了51.89%(图3C).随后逐渐下降，至测试周期结束时(病菌接种后的第16天)，PPO 活性回复到接种前的水平.

X.axonopodis ABB 接种后红掌叶片PAL 活性一直呈现出平稳增加的状态，其活性峰值出现在病菌感染后的第12 天，其活性与接种前比较增加了66.43%(图3D).随后逐渐下降，但在测试周期结束的最后一天(第16 天)，该酶活性仍然显著高于非接种对照(P ＜0.01).

2.4 X. axonopodis ABB－2 对红掌游离酚含量的动态变化

X.axonopodis ABB 接种后测试周期，红掌叶片游离酚含量一直呈现平稳增加的状态(图4)，接种后16 d，其含量较对照增加了34.66%.

3 讨论

本研究中，X. axonopodis ABB－2 接种红掌“阿拉巴马”后，叶片呈现典型的细菌性叶斑病叶部感染症状，且病情发展迅速(图1、表1).此外，该病菌接种后，不仅引起红掌叶部感染，而且其花絮也出现黑褐色病斑(结果未显示). 这些结果说明X. axonopodis ABB－2 为红掌细菌性叶斑病的强毒病原，与该病菌分离自红掌“阿拉巴马”细菌性叶斑病典型病株一致.

图3 X.axonopodis ABB－2 诱导寄主红掌不同酶活性的动态变化Figure 3 Changes in different enzyme activities in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

图4 X.axonopodis ABB－2 诱导寄主红掌游离酚含量的动态变化Figure 4 Changes in free phenol content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X. axonopodis ABB－ 2 and control Anthurium plant

SOD 和POD 是植物细胞内抵御活性氧(Reactive oxygen species，ROS)伤害的2 种主要保护酶，其活性变化可间接反映植物体内活性氧代谢的变化，也常作为植物抗病性的重要指标［5－8，17］. 植物受到病害侵染后，会产生大量的ROS，ROS 的积累将激发植株体内抗氧防御相关合成酶基因的表达，表现为抗氧化酶活性上升. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染红掌“阿拉巴马”后同样诱导了寄主红掌叶片SOD 和POD 的增加，间接说明该病菌感染引起了“阿拉巴马”红掌植株ROS 的迸发. ROS 迸发是植物受到病原菌侵害时，最快的防卫反应之一［17］.X.axonopodis ABB－2 感染红掌“阿拉巴马”后，随着感染时间的延长，病情发展加剧，而被感染的植株叶片SOD 和POD 活性在感染的中后期迅速而持续下降到低于非接种对照的水平. 这个结果提示ROS 迸发并不足以杀死红掌所感染的X.axonopodis ABB－2 病菌，相反，该病菌在该植株内的增殖破坏了该植株的抗氧化防御系统，使之活性显著降低.过多的活性氧积累对植物也具有严重的毒害作用，甚至导致细胞或植株死亡［17］. 本研究的结果也初步提示感染后活性氧产生与清除动态平衡的破坏可能也是X.axonopodis 对红掌致病性的因素之一.

多酚氧化酶可催化木质素及其它酚类氧化产物的形成而发挥抗病作用［8］.苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢的第一关键酶，与包括木质素、香豆素、黄酮、类黄酮衍生物等在内的植物抗毒素的合成密切相关［18］.对PAL、PPO 与植物抗病性的关系，大多报道认为该二种酶在植株受病原菌侵染后其活性升高，并与抗病性呈正相关［5－10］. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染红掌“阿拉巴马”后，红掌叶片PPO 活性升高达到一个峰值后下降到非接种对照植株水平，与大多数报道一致.而该病菌感染后红掌叶片PAL 活性达到最大值，且该酶维持高活性的时间明显大于其他所测试的防御相关酶，提示该病菌诱导红掌PAL 活性的提高可能是红掌抗细菌性叶斑病的重要因素.植物细胞内存在的酚类化合物可通过抑制病菌生长、病原物毒素及酶的产生或使其钝化等多种方式参与对病原的抵御. 本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接种诱导了红掌叶片游离酚含量持续的增加. 稻黄单胞菌菌侵染寄主水稻后也引起寄主游离酚含量显著增加，与目前的研究结果一致［5］.

病程相关蛋白(PRP)是植物受病原物或不同因子刺激、胁迫所产生的一类具有广谱抗性的可溶性蛋白质.植物在病原胁迫下组织中可溶性蛋白含量的变化可间接反映PRP 的变化.本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接种后红掌叶片可溶性蛋白含量其最大值较非接种对照增加了21.76%，提示该病菌感染可诱导红掌PRP 的表达.但该病菌接种后红掌PRP 中各个成员的表达及其差异有待进一步验证和研究.

革兰氏阴性病原细菌大多能分泌Harpin 类蛋白，许多研究发现该类蛋白能激活寄主、非寄主抗病防卫、生长防御相关的多条信号途经［19］. 在前期工作中作者发现X.axonopodis ABB－2 能合成Harpin蛋白.X.axonopodis ABB－2 诱导寄主红掌抗病、防御相关生化指标的升高是否由Harpin 蛋白介导有待进一步研究.

［1］GANTAIT S，MANDAL N. Tissue culture of Anthurium andreanum:A significant review and future prospective［J］. Int J Bot，2009，201，6:207－219.

［2］LAURENT P，CHABIRAND A，JOUEN E，et al. A new semi－selective medium for the isolation of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae，the etiological agent of anthurium bacterial blight［J］. Lett Appl Microbiol，2009，49(2):210－216.

［3］KELANIYANGODA D B，DWICKRAMARATHNE M S.Development of pre－ detection technique for bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae)disease in Anthurium to produce healthy planting materials［J］. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2009，7:643－649.

［4］卢梦玲，周晓云，曾伟达，等. 红掌细菌性疫病病原菌的PCR 特异性检测［J］. 植物病理学报. 2012，42(1):1－9.

［5］SHARMA N，KAUR C，JAGJIT S，et al. Biochemical responses associated with bacterial blight of rice (Oryza sativa)［J］. Archives of Phytopathology and Plant Protection，2012，45(1):47－61.

［6］VARGAS W A，SANZ－ MARTÍN J M，RECH G E.Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development Colletotricum graminicola in maize［J］. Plant Physiology，2012，doi:http://dx.doi.org/10.1104/pp.111.190397.

［7］王利英，侯喜林，刘琳，等. 甘蓝链格孢菌侵染对白菜保护酶活性和H2O2含量的影响［J］. 园艺学报，2008，35(7):1065－ 1068.

［8］李赤，黎永坚，于莉. 香蕉枯萎病菌对不同香蕉品种防御酶系的影响［J］. 中国农学通报，2010，26(17):251－255.

［9］LIN J H，GONG D Q，ZHU S J，et al. Expression of PPO and POD genes and contents of polyphenolic compounds in harvested mango fruits in relation to enzothiadiazole－induced defense aga inst anthracnose［J］. Scientia Horticulturae，2011，26(1):85－89.

［10］李琳琳，李天来，余朝阁，等. 钙素对SA 诱导番茄幼苗抗灰霉病的调控作用［J］. 园艺学报，2012，39(2):273－280.

［11］高惠兰，柳振誉，叶静水，等. 冷锻炼对低温胁迫下红掌叶片膜脂过氧化及保护酶活性影响［J］. 福建农业学报，2005，20(2):108－112.

［12］田丹青，葛亚英，潘刚敏，等. 低温胁迫对3个红掌品种叶片形态和生理特性的影响［J］. 园艺学报，2011，38(6):1173－1179.

［13］王学奎. 植物生理生化实验原理和技术［M］. 北京:高等教育出版社，2006.

［14］BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein2dye binding［J］. Analytical Biochemistry，1976，172:248－254.

［15］李合生.植物生理生化实验原理和技术［M］.第1 版.北京:高等教育出版社，2000.

［16］罗晓芳，田砚亭，姚洪军. 组织培养过程中PPO 活性与总酚含量的研究［J］. 北京林业大学学报，1999，21(1):92－95.

［17］FONES H，PRESTON G M. Reactive oxygen and oxidative stress tolerance in plant pathogenic Pseudomonas［J］. FEMS Microbiology Letters，2012，327:1－8.

［18］MACDONALD M J，D'CUNHA G B. A modern view of phenylalanine ammonia lyase［J］. Biochem Cell Biol，2007，85:273－282.

［19］REN H Y，GU G，LONG J. Combinative effects of a bacterial type－III effector and a biocontrol bacterium on rice resistance［J］. J Biosci，2006，31:617－627.