皮下埋置实验对增塑淀粉生物安全性的评价

徐小川，姚 源，田 伟

(1北京积水潭医院，北京100035;2北京市创伤骨科研究所)

淀粉作为天然高分子化合物在可再生资源中占据非常重要地位，具有丰富、价廉、可再生、不枯竭、污染小、可生物降解、生物相容性好、稳定性高、安全、无毒等特点，尤其经过适合的结构重组或修饰，可赋予抑制结肠癌、降低胆固醇、减少心血管疾病等生理活性，因而对其研究和利用日益引起国际上的高度重视［1］。增塑淀粉是北京市新型高分子材料制备与加工重点实验室研发的新型生物可降解材料，强度和弹性大大优于普通淀粉;对小分子具有很好的吸附性，强于海藻酸盐类多糖，加入止血材料或成骨因子有望在生物医药领域有广泛的应用前景。因此，评价这一类医疗器械及材料植入体内的风险性也就显得相当复杂且需要更加谨慎。此前，已经对该材料的细胞毒性进行测试［2］，部分反映了材料的安全性。为进一步评估材料的安全性，我们于2006年5月～2007年4月进行皮下埋置实验。本实验以Wistar大鼠为研究对象，依照YY/T 0127．8-2001(ISO 10993-6:1994)［2］进行皮下埋置实验，观察埋置后4、8、12周局部反应。选择S-99可溶性止血纱布作为对照材料，S-99主要成分为纤维素，与淀粉均为高分子天然有机物，临床中用于外用局部止血、保护创面，与实验材料预期临床使用相似。

1 材料与方法［3］

1．1 材料 依照中华人民共和国医药行业标准，实验动物采用Wistar大鼠，雌雄不限。增塑淀粉类材料需填装入直径1．5 mm、长5 mm的管内。选用临床使用的输液器胶管，制成规定形状，胶管植入前经高温高压消毒。增塑淀粉经60Co照射消毒备用，对照为S-99可溶性止血纱布(金台牌，北京纺织科学研究所，密封包装)。

1．2 方法

1．2．1 埋置方法 术前1 d对动物手术部位脱毛。手术当日受试动物腹腔注射水合氯醛0．7 mL麻醉，固定后用碘伏对脱毛部位消毒，然后铺巾。在大鼠背部两侧距脊柱各1 cm处切开皮肤，切口长约1．5 cm;分离皮下组织，将胶管于无菌情况下植入大鼠背部皮下，每侧各有两个植入点;实验侧和对照侧胶管植入皮下前分别填入增塑淀粉和止血纱布，止血，缝合线缝合。

1．2．2 观察方法 实验动物在埋植实验材料后，分别于4、8、12周后分期处死。取出包括皮肤、皮下组织的植入块，仔细修整组织块并取出植入物，对界面和材料周围组织进行大体观察。然后，将标本置于10%甲醛中固定2 d，石蜡包埋切片，沿植入物长轴切片，苏木精—伊红(HE)染色，组织学观察。主要观察纤维包膜的形态和结构、炎细胞浸润程度，以及有无脓肿、变性坏死、增生等情况。

1．2．3 评价方法 根据管端组织有无变性、坏死及其程度、炎症细胞的数量、类型和浸润范围进行组织学评价，将组织反应程度分为以下4级。重度反应:管端组织失去原有形态结构，形成大面积坏死区，较多嗜中性多形核白细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润;中度反应:管端组织小范围变性坏死，呈中度的炎症细胞浸润;轻度反应:管端组织无变性坏死，散在少量慢性炎症细胞，可见到淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞及异物巨细胞存在;无反应:管端组织没有炎症细胞浸润，可由薄层纤维组织包绕小管。

2 结果

实验动物术后活动正常，进食好，伤口一期愈合，无伤口感染。第4周取材中发现，实验侧及对照侧胶管均被纤维包膜完整覆盖，附近组织无红肿、无血凝块。HE切片显示，实验侧与对照侧均表现为异物反应，实验侧视野有肉芽肿，均属轻度反应。见插页Ⅰ图3。第8周取材中发现实验侧及对照侧胶管周纤维包膜厚度较前期无明显变薄，外观形状无明显变化。HE切片显示，实验侧与对照侧均表现为吞噬反应，均属轻度反应。见插页Ⅱ图4。第12周实验侧及对照侧胶管周纤维包膜厚度较第8周无明显变薄，HE切片显示实验侧与对照侧均表现为吞噬反应，均属轻度反应。见插页Ⅱ图5。

3 讨论

淀粉作为天然高分子化合物，在可再生资源中占据非常重要地位。2001年，美国、比利时和以色列等国的研究人员发现，丙烯酸接枝玉米淀粉及淀粉与聚丙烯酸共混物均表现出较高的抑制胰蛋白酶活性的能力，以及对钙、锌离子有较强的吸附能力，适合作为多肽、蛋白质药物的靶向给药载体［4］。

采用海藻酸盐作为组织工程骨支架载体，具有促进骨缺损部位骨愈合、防止出现骨不连等优点［5，6］，但其凝胶在生理环境中易溶解并失去凝胶特性，此过程不能控制和预测;同时，因其具有较强的亲水性，故对蛋白质吸附较差，缺乏细胞特异性作用位置。许多研究集中于海藻酸盐改性或者替代物。目前，研究最多的可吸收支架材料是聚乳酸或聚乳酸—羟基乙酸共聚物［7］，但是二者在降解过程中容易产生酸，易引起周围组织的炎症反应。增塑淀粉强度和弹性大大优于海藻酸盐及普通淀粉，对小分子具有很好的吸附性。朱爱臣等［8］以本实验材料为基础制备了淀粉/聚乙烯醇引导组织再生膜，以期应用于颌面和身体其他骨组织缺损的修复。

本实验中4、8、12周3个阶段，实验侧及对照侧的炎性反应一直存在且程度相似，显示增塑淀粉的安全性不低于对照材料。这可能是因为皮下组织富含血管及疏松结缔组织，异物反应表现强烈。同时，通过组织学切片可见放置材料的输液器胶管周围出现纤维包膜增厚，而管内并未有明显的炎症反应，提示组织学所见的细胞吞噬反应部分源于组织对胶管的反应。

本实验采用自身左右对照［9］，在所有的观察期发现实验侧、对照侧均表现为异物反应，未见坏死组织，参照行业标准属轻度反应，说明增塑淀粉在组织局部的毒性反应在可接受范围。完全没有不良作用的材料是很难找到的。生物医用材料及装置植入人体后，必定引起组织反应、血液反应、免疫反应及全身反应等生物学反应［10］，而其中又以组织反应和血液反应为初始反应。例如，植入物周围组织将出现白细胞、淋巴细胞和吞噬细胞的聚集，并发生不同程度的急性炎症。其感染的原因包括:植入手术过程中，皮肤或组织损伤，给微生物的侵入提供机会;生物医用材料灭菌不彻底带来的污染，生物医用材料本身引起的无菌性炎症等。因而，在生物学评价中要遵循设立对照的原则，只有这样才能获得结果的可比性。

有研究对若干生物材料采取白细胞趋化试验、流式细胞仪法等体外试验方法，以及大鼠皮下埋植、兔肌肉内埋植等体内试验，来评价材料的组织毒性，并进行比较研究，对体内外试验方法和结果进行相关性分析，结果表明体外、体内方法有良好的相关性［11］。因而，对于任何生物材料还应该参照现有标准进行相应的体内外联合试验。

［1］Martinez-Floresa HE，Changb YK，Martinez-bustosc F，et al．Effect of high fiber products on blood lipids and lipoproteins in hamsters［J］．Nutrition Res，2004，24:85．

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［3］中国标准化出版社第一编辑室．医疗器械标准汇编(口腔材料卷)［M］．北京:中国标准化出版社，2002:41-43．

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［10］李玉宝．生物医学材料［M］．北京:化学工业出版社，2003:22-25．

［11］张彩霞，闻学雷．生物材料体内外试验相关性研究——细胞与软组织毒性［J］．中国生物医学工程学报，2001，21(2):122-127．