西藏乳及发酵乳制品中乳酸菌与酵母菌分布

罗 章，陈历俊 ，陈历水，周伟明

(1.西藏大学农牧学院，食品科学学院，西藏林芝860000;2.北京三元食品股份有限公司，科研中心，北京100086;3.中粮营养健康研究院，食品研发中心，北京100020)

近年来，西藏当地牦牛乳及发酵乳制品中的微生物分布备受科研人员的关注，而且重点多集中在其中的乳酸菌和酵母菌的研究。乳酸菌是一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌总称，是一类在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧菌，这类细菌在自然界中分布极广。与乳品有关的乳酸菌种属主要有:乳杆菌属 (Lactobacillus )、双歧杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostocs)、芽孢杆菌属(Bacillus)和片球菌属(Pediococcus)等。随着食品科技的发展，消费者对口感和健康的需求日益增强，发酵乳制品中的酵母菌也受到了越来越多的关注，不断有研究发现酵母菌作为附属发酵剂对乳制品发酵和成熟过程中的风味影响、抑制有害菌的生长及对人体的潜在益生作用等［1，3-5］，有些酵母菌还会对发酵乳制品提供有益作用，尤其对干酪的风味和质构形成起到了非常重要的作用。不仅能利用凝乳中的乳糖发酵产生的乳酸，使凝乳的pH 有所升高，刺激有助于干酪成熟的细菌生长;而且还能产生胞外蛋白分解酶和脂肪分解酶，使干酪中可溶性含氮物和辛酸、癸酸等高级脂肪酸增加。酵母菌在发酵葡萄糖等单糖的过程中能产生CO2气体，CO2气体的产生为干酪形成孔状结构提供了必要条件［6］;同时，酵母菌还能抑制腐败微生物和梭状芽孢杆菌的生长［7］;产生多种水溶性维生素，提高乳制品的营养;除此以外，酵母菌还具有预防和治疗急性痢疾［8-9］、降低胆固醇［6］、抗辐射［10］和抗氧化［11］等益生活性。本文对西藏原料乳及发酵乳制品中的乳酸菌和酵母菌的分布情况进行了归纳整理，以期为相关的科研人员提供工作方便。

1 原料乳

原料乳是乳酸菌和酵母菌容易繁殖的小生境，是发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的主要来源之一，很多发酵乳制品如Kefir、Viili 以及获得原产地保护认证(ProtectedDesignation of Origin，PDO)的法国Cantal 干 酪、 Camembert 干 酪 和 意 大 利TomaPiemontese 干酪均以原料乳直接加工而成，其中的乳酸菌和酵母菌赋予了产品特殊风味和提升健康的品质［12］。西藏的牦牛乳具有蛋白质、脂肪、乳糖和矿物质含量高等特性，被称为“天然浓缩乳”，是高原地区人民重要的食品和乳品加工原料，也是乳酸菌和酵母菌栖息地所在。有研究发现牦牛原料乳中含有乳酸菌、酵母菌等有益菌，这些有益菌含量随着海拔高度的增加有所增加。由于牦牛均为散养，生活环境的卫生情况较差，所以牦牛原料乳中的有害微生物太多，直接用生乳做成的乳制品较少，目前很少有研究对原料中有益微生物进行筛选鉴定［13］。

2 西藏曲拉

西藏曲拉(藏语，指奶渣)，是藏族牧民将牦牛乳经过脱脂后(制酥油后)自然发酵使酪蛋白凝结风干而制成的一种白色或黄色硬制颗粒状的干酪，是几千年来传统的藏族食品。西藏的曲拉是利用原料乳通过传统工艺制作的，环境中的微生物在干酪发酵的过程中起着重要的作用。作为自然的或经选择后添加的发酵剂，乳酸菌是曲拉中最重要的菌群。藏族通常在夏季制作曲拉并添加酸奶，因此，曲拉不仅是藏族贮藏食品蛋白的重要手段，而且是某些地区制作酸奶的发酵剂。由于青藏高原地处中国西北地区，平均海拔4000m 以上。属于特殊的生态学区域，具有生物的广泛性和特殊性，从而对曲拉中的微生物区系和典型风味的形成产生一定的影响。有研究发现每克新鲜曲拉样品中的乳酸菌落总数为103～107个，酵母菌的菌落总数为103～108个，其中乳酸菌在大多数曲拉样品中为优势菌群［14］。

段宇珩［15］等人对藏族传统乳制品曲拉中的微生物进行分析后发现，其中大多数微生物主要是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性和兼性厌氧。曲拉的自然发酵过程受到乳杆菌(Lactobacillus)，乳球菌(Lactococcus)，有时也包括肠球菌(Enterococcus)的控制，并且这些菌在曲拉中占优势地位。通过生理生化分析后发现与其他种类干酪不同的是，曲拉中的大多数乳酸菌均属于明串珠菌属(Leuconostoc)，占总数的 78%，而从曲拉中分离到的乳杆菌属(Lactobacillus)仅占15%，并不是优势属，肠球菌属(Enterococcus)仅为7%，是次要的属。此外，大多数分离得到的乳酸菌为异型发酵，占总数的70%以上。

西藏曲拉中的酵母菌具有丰富的生物多样性，有研究发现西藏曲拉中酵母菌的总数在106～107cfu/g 之间，曲拉中的酵母菌平均数比云南乳饼样品中的酵母菌要高34 倍，其中西藏曲拉的优势菌株为发酵毕赤氏酵 母 (Pichiafermentans ) 和 酿 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae)。

3 藏灵菇乳

3.1 藏灵菇乳的功能活性

藏灵菇乳是西藏地区的传统发酵乳制品。藏灵菇发酵乳实质上是利用藏灵菇作为一种天然发酵剂对牛奶进行发酵，这种发酵剂含有多种乳酸菌和酵母菌，也有部分醋酸菌。目前在世界各国的发酵乳制品中，有酵母菌参与的只有两种，一种是kumiss(也称koumiss)，另一种是开菲尔(kefir)。这类饮品由于其独特的保健效果，在民间广为流传，据说长期饮用能增强人体免疫力、补充维生素、延缓衰老、消除疲劳，特别适合胃病、肾病和肝胆病患者。藏灵菇来源于西藏，是一种多菌种的复合体由数种乳酸菌、酵母菌和醋酸菌共生而成一种粒状乳制品发酵剂菌体，呈乳白色、胶质状，外形酷似米粒，可在鲜乳中生长、分裂并将其特性传给下一代以产生新粒，由于经过长期在牛奶中培养，体积会增大很多，形状如盛开的雪莲，所以有人称之为“西藏雪莲”。其外观、微生物组成及发酵特性与流传于东欧高加索地区的开菲尔粒(kefir grain)类似，但前者源自我国雪域高原，它的研究与开发有独到之处，具有知识产权。藏灵菇实质上是一种开菲尔粒，藏灵菇乳也就是一种开菲尔。鲜乳经过开菲尔粒发酵后，由于益生菌的代谢作用，鲜乳中的蛋白质、脂肪及乳糖均不同程度发生了降解;其中脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸的含量均具有显著增加，游离脂肪酸和挥发性脂肪酸含量也有所升高，这些大分子物质的降解使蛋白质和脂肪更易于消化吸收;而且大部分乳糖被水解，β- 半乳糖苷酶含量增加，适宜乳糖不耐者饮用［13］。

开菲尔中酵母菌的抑菌活性通常认为是通过代谢物乙醇、亚硫酸盐实现，也有人认为是在代谢过程中分泌了一些毒素蛋白，这些毒素蛋白起到了杀死敏感微生物而显示出较强的淬火毒素作用［16］。起初认为具有杀菌活性的酵母菌只对亲缘关系密切的同种其它菌株有杀菌活性，后来逐渐发现它们对其它真核生物如丝状菌属也有抗性，甚至对细菌，如革兰氏阳性菌、阴性菌和生长缓慢的结核分支杆菌都有抗性，而且对不相关的葡萄球菌、肠杆菌、绿脓杆菌和副溶血性弧菌等均有杀菌活性，在现有的嗜杀酵母菌中、Pichia 和Hansenula 的杀菌活性最强。酵母菌产生的杀菌毒素是一种糖蛋白，它由特定的质粒编码、毒素效应与敏感微生物的胞壁受体结合，导致细胞内pH 显著下降、代谢抑制、细胞死亡。可见酵母菌在生长代谢过程中产生的有抗菌、抗病活性的物质可能是乙醇、亚硫酸盐、乳酸等有杀菌作用的小分子物质、肽类及其他一些未知成分的抗菌素、杀菌毒素糖蛋白［17］。同时，有研究发现，在开菲尔中，酵母菌不仅能产生B 族维生素，而且具有抗菌活性，尤其对肺结核分支杆菌的抑制作用明显;酵母菌细胞表面还能通过甘露糖特异性反应吸附肠内细菌排出的肠毒素［2］。又有研究人员发现工业酵母菌里含有“嗜杀因子”，这种由酵母菌分泌的蛋白质或糖蛋白混合物“嗜杀因子”对肠内细菌有明显的抑制作用，同时，其分泌的短链脂肪酸和其他的一些特殊的物质也可以对肠道内的有害菌起到抑制作用。发酵产生的乳酸和二氧化碳成分则有改善口感，促进唾液分泌和肠道蠕动［18-19］等作用。

从我国传统的西藏灵菇中已分离出高效降胆固醇的菌株KM-16。开菲尔因含有抑制癌细胞增殖的荚膜多糖，因此可降低癌症发病率，有抗肿瘤作用。开菲尔还是一种增强机体免疫力的营养食物，被用于AIDS 病患者、慢性疲劳过度患者以及疱疹患者的饮食疗法中。目前根据对其起疗效作用的活性特质、微生物形成的抑制致病菌的抗菌性物质、抑制癌症的发生和抑制癌细胞增殖物质的研究，认为开菲尔确实是具有使人长寿、祛病延年的神奇饮料。开菲尔中的活性物质可以降低血中的胆固醇水平以预防心血管疾病。

3.2 藏灵菇乳中的乳酸菌和酵母菌

藏灵菇有良好的发酵特性，它与传统的酸奶或用其他纯种乳酸菌发酵剂制成的产品有很大的不同，最显著的特征是除乳酸发酵外，还伴有轻微的由酵母菌引起的酒精发酵，是一种集酸味、醇味为一体的新型发酵乳制品。经研究表明，藏灵菇中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌，其中乳酸菌主要包括乳杆菌和乳球菌，具体为开菲尔乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌;酵母菌包括啤酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母、单孢酵母，其中以耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、亚罗克鲁维酵母(Yarrowia lipolytica)为主体酵母菌，以乳酸杆菌、短乳杆菌和乳酸链球菌等乳酸菌为主体细菌构成的块状共生菌系，以酵母假丝和营养体构成菌块中心，有乳酸菌分布在菌块外周部分共同完成复杂的牛乳发酵分解过程;也有报道含有醋酸菌、双歧杆菌等，菌落数与采样的地域不同、海拔不同而差异很大。通过对藏灵菇进行电镜扫描发现藏灵菇内层菌群密度比外层小，以弯曲杆菌为主，还有部分椭圆形酵母，外侧菌群密度较大，绝大部分是短杆菌，同时还有部分酵母菌分布在表层［20］。

开菲尔发源地是在高加索地区，后逐渐在前苏联、东欧、中东、西德、瑞士和北欧等地传播，近年来在美、英、加拿大以及日本等国开始普及，开菲尔不仅具有一般饮料所没有的爽口感和风味，而且在营养上属于低热值低糖富含蛋白质和维生素的优质饮品，并对胃肠疾病代谢系统疾病高血压局部贫血心脏病和过敏症等疾病也有良好的治疗作用。正由于其独特的风味特点以及营养生理和保健功效，开菲尔的研究开发和生产越来越受到人们的关注。开菲尔最典型的发酵剂是通过开菲尔粒在乳中生长制得的，开菲尔粒的基本微生物菌丛是乳酸菌、酵母菌和醋酸菌。它们分布在粒子不同的层次上，一般酵母菌分布在粒子的外表层，而乳酸菌和醋酸菌分布在内部。开菲尔中的乳酸菌主要包括乳球菌属、乳杆菌属和明串珠菌属;酵母菌包括乳糖发酵型和乳糖非发酵型两类，前者包括乳酸酵母、脆壁酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酒假丝酵母等;后者包括啤酒酵母、德氏酵母等;醋杆菌是开菲尔中唯一的醋酸菌［21］。

陈芝兰等［22］通过对西藏牧民家庭制作的牦牛发酵乳制品中酸奶和奶渣的微生物数量进行分析，采用传统分类与16SrRNA 基因序列测定的方法对分离的乳酸菌进行鉴定。发现3 份发酵牦牛乳样品中乳酸菌数为1.04 ×104～2.10 ×106CFU/mL，酵母菌数为8.20 ×103～6.70 ×105CFU/mL;共分离15 株乳酸杆菌、4 株乳酸球菌和3 株酵母;乳酸菌中10 株为Lactobacillus paracasei、1 株Lactobacillu fermentum、2株Lactobacillus reuteri、1 株Lactobacillus brevis、1 株Lactobacillus delbrueckii sp.bulgaricus、2 株Pediococcus acidilactici、另有Pediococcu 和Lactococcus 各1 株，未鉴定到种;L.paracasei 为牦牛发酵乳制品中乳酸菌的优势种(占总分离株的55.6%)。艾日登才次克［14］采用形态学观察、生理生化实验、糖发酵实验、乳酸旋光性测定等传统鉴定方法与16S rDNA 序列同源性分析相结合的方法对44 份发酵乳样品中分离出122株乳酸杆菌和49 株乳酸球菌，进行鉴定，结果却不一样，其中 Lactobacillus fermentum 和 Lactobacillus casei 是最常见的菌株，分别占总分离株的29.9%和26.9%。其次为 Lactococccus lactis sp. lactis 和Lactobacillus plantarum，同时还分离出了Lactobacillus helveticus、Lactobacillus curvatus、Enterococcus duarus、Enterococcus faecium、Lactococccuslactis sp. cremoris、Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides、Leuconosto cpseudome-senteroides、Lactococccus garvieae。

有研究人员从藏灵菇乳中分离筛选出8 种乳酸菌和5 种酵母菌，即乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌和马克斯克鲁维酵母为纯培养发酵剂的组合菌。有对比实验发现西藏开菲尔粒中的乳杆菌的数目和种类要多于乳球菌，且大部分为短杆菌，而俄罗斯地区的开菲尔粒中的主要微生物则是乳球菌的数量是最多的，其次是链球菌、乳杆菌，同保加利亚地区的开菲尔粒在菌相分布上有相似性。实验结果显示，从开菲尔粒中分离的乳酸菌都具有凝乳能力，但是凝乳时间凝乳质地差异显著，另外各菌株间的半乳糖苷酶活性的差异也比较显著。另外，开菲尔粒中的酵母菌还是重要的益生菌来源，从开菲尔粒分离出耐酸、耐胆盐和耐高温，发酵性能良好的开菲尔假丝酵母，及高产叶酸的假丝酵母和酿酒酵母［23］。西藏开菲尔发酵乳在发酵过程中乳酸菌与酵母菌的增殖具有不同的发展趋势，发酵前期(0～3h)，开菲尔粒中的微生物连续快速地进入牛乳，形成初始菌系，在牛乳中不断增殖，乳酸菌在发酵过程中生长较快，数量较多，酵母菌生长较慢，数量相对较少，具体而言，发酵前期，氧气供应较为充分，酵母菌在这种弱酸性条件下，逐步适应环境，生长缓慢，乙醇增加缓慢;其后(6～16h)，酵母菌完全适应了周围环境而不断生长，并利用乳糖半乳糖和葡萄糖进行厌氧发酵，开始产生大量的乙醇，此外，发酵过程中乳酸菌代谢产生的丙酮酸等物质也会被酵母菌直接利用，从而进一步加快酵母菌的生长繁殖及提高乙醇的产率。20h 后，发酵乳的营养物质消耗将尽，菌体生长达到稳定期，发酵乳的酸度也达到稳定趋势［24］。

4 小结

随着消费者对发酵食品保健功能的认识越来越深刻，西藏牦牛原料乳及发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的研究成为广大科研工作者的研究热点，其中包括乳酸菌和酵母菌的菌种筛选、鉴定以及发酵乳制品新的保健功能的发现和保健功能机理的探索，但是这些研究目前大多数还在理论研究阶段，还缺乏系统的与工业化相结合的研究。因此，科研院所联合相关企业利用西藏乳及发酵乳中筛选得到的一系列益生菌株进行深入研究，并将这些有益的菌株应用于工业化生产中，包括乳制品中、肉制品及其他的发酵食品中，实现产学研一体化将是今后的主要发展方向，从而达到实现真正意义上的以科研服务企业、服务消费者。

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