副猪嗜血杆菌的诊断与防治

潘传毅

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

副猪嗜血杆菌病（HPS）是由副猪嗜血杆菌（Hps）引起的一种泛嗜性细菌性传染病，1906年由德国学者Gllisser发现，故又称“革拉瑟氏病”[1]。本病以纤维性多浆膜炎、脑膜炎和多关节炎为主要特征，并伴有发热、咳嗽、呼吸困难、共济失调和被毛粗乱等症状。Hps主要侵害仔猪尤其是早期断奶仔猪，4～8周龄的猪对Hps也较敏感，本病的发病率一般为10%～20%，病死率有时可高达50%。本病呈世界性分布，据不完全统计，有38.9%～77.8%的猪携带潜在致病菌[2]。我国也从规模化养猪场中分离到了该病原菌。Hps感染已经成为早期断奶仔猪和高度健康猪群的威胁，严重的影响了地区及世界经济的发展，本文综述了HPS的诊断与防治。

1 诊断

1.1 微生物学诊断

Hps是一种极难培养的细菌，通常很难从患病动物的纯培养物中分离到该菌，尤其是发病猪经抗生素治疗后，该菌的分离更为复杂。然而，细菌的分离非常重要，因为只有分离到细菌后才能作进一步的检测。无菌采集胸腹腔积水、心包液、心血、关节液，分别接种于添加辅酶的副嗜血杆菌培养基平板，于37℃，5%CO2培养箱中培养24～48 h，结果均长出无色、透明、湿润、光滑的露珠样细小菌落。同时将该细菌进行革兰氏染色，结果呈阴性、小球杆菌，老龄培养物呈多形态（细小杆状、短链状和长丝状）。由于存在被其他易生长细菌干扰等因素，因此临床检验中未分离到细菌并不代表Hps不存在。Hps在PBS（磷酸盐缓冲液）中的存活时间分别为：42℃1 h、37℃2 h、25℃8 h，因此样品采集后应立即培养或低温运送到实验室。

1.2 血清学诊断

血清学方法主要有琼脂免疫扩散试验（AGP）、补体结合试验（CFT）、间接血凝试验（IHA）以及酶联免疫吸附试验（ELISA），血清学方法具有反应灵敏、方便快捷的特点，适合于临床大规模检测。AGP是抗原、抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当时相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，目前最常用的是双向单扩散和双向双扩散。IHA是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒表面，然后与相应的抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下发生特异性凝集反应。魏子贡等将Hps血清4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞，建立了检测Hps抗体的IHA，该法灵敏度高，但特异性差。ELISA是当前应用最广、发展最快的一项新技术。将抗原（或抗体）吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色反应，底物显色后用分光光度计或肉眼判定结果[3]。王艳等采用福尔马林灭活的Hps全菌体作为包被抗原，建立了检测Hps抗体的间接ELISA方法，确定Hps全菌体的包被浓度为2.24×107cfu·孔-1、检测血清为1：200稀释，同时确立了间接ELISA的最佳反应条件，结果表明，该方法有很高的特异性和重复性，14个发病猪场100份血清检测结果Hps抗体阳性检出率为94%[4]。Nedbalcova等用Hps超声裂解抗原致敏红血球，建立了Hps抗体间接血凝检测方法，具有敏感性高、特异性强、重复性好等特点，可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查[5]。

1.3 分子生物学诊断

研究者根据细菌染色体上16srRNA基因的高度保守和具有种属特异性的特点，建立了PCR诊断方法，该法具有特异性强、灵敏度高、操作简单和省时等特点。万世平等根据Hps 16S rRNA基因设计了一对引物，通过最佳条件摸索扩增出大小为821 bp的特异目的基因片段，建立了快速检测Hps的PCR方法，该方法最低检出量达10-3ng，且对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌等均无交叉反应[6]。常规PCR只能进行定性，而不能定量DNA模板的拷贝数。随着荧光定量PCR技术的快速发展，荧光定量PCR技术越来越多地应用于疾病的检测。荧光实时定量PCR技术就是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累计实时监测PCR反应过程，最后通过标准曲线对位置模板进行定量分析的方法。李军等建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝·μL-1，重复性好，变异系数均＜2%，该方法特异性强，只能检测Hps，不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5A和猪伤寒沙门氏菌[7]。于江等采用煮沸法从Hps培养物中提取DNA，进行PCR扩增，将鉴定正确的目的基因片段克隆入pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5A，经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒，作为阳性标准品，结果表明，该方法对Hps具有良好的特异性，不与其他猪源细菌发生交叉反应，其敏感性比常规PCR高100倍，而且非常稳定，批间与批内重复试验变异系数均＜2.5%[8]。苗立中等提取Hps基因组，设计特异性引物，进行PCR扩增，回收目的片段，构建阳性标准模板，建立标准曲线，建立基于SYBR Green I的快速检测Hps的实时荧光定量PCR方法，结果表明，线性关系在102～108copies·μL-1检测范围内良好；该方法敏感性比常规PCR高100倍，重复性试验变异系数均小于205%，同时对Hps具有良好的特异性，建立的Hps SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对Hps的快速诊断和定量检测[9]。

1.4 其他

由于杂菌滋长而使Hps分离异常艰难，因此用免疫组化法（IHC）来诊断Hps感染时，即使Hps已被巨噬细胞杀灭而遗骸于胞浆中，也可轻易地被检测到，但所使用的多克隆抗体与胸膜肺炎放线杆菌有交叉反应。曹芸等利用原核表达并经过纯化的Hps TbpB N端蛋白及人工合成的特异性多肽制备单克隆抗体，经碳化二亚胺（EDC）将纯化后的单克隆抗体IgG与羧化乳胶共价偶联，并对偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件进行合理选择，建立了快速检测Hps的乳胶凝集试验方法，结果表明，利用该方法检测Hps疑似菌株，与16S rRNA-PCR方法的结果相比，符合率为83.1%，且致敏乳胶不与临床常见菌株发生凝集反应，该方法具有操作简便、快速、特异性高的特点[10]。宋凤香等从山东某繁育猪场送检的疑似病例中分离到4株革兰氏阴性细小杆菌，通过培养特性试验和生化试验初步诊断为Hps，根据Hps 16S rRNA序列设计引物，进行PCR鉴定，结果表明4株分离菌株为Hps，对4株分离菌株进行小白鼠毒力试验和药敏试验，结果表明，4株分离菌能致死小白鼠，对头孢他啶、头孢噻呋、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星敏感，对土霉素、链霉素、林可霉素抵抗[11-13]。

2 防 治

2.1 饲养管理

应合理配制饲料，保证营养充足、平衡供给，特别是蛋白质和维生素及矿物质的供给。饲喂要做到定时、定量，提高饲料品质。降低饲养密度，加强猪舍通风对流，提高舍内空气质量，冬季注意御寒保暖，夏季做好防暑降温工作，减少断奶、转群、混群或运输过程中应激对猪群的伤害。提高猪的抗病能力，减少该病的发生。

2.2 预防

疫苗的使用是预防Hps造成损失最为有效的方法之一，但是由于该病血清型多，免疫前要弄清该病在主场流行的血清型，选择相对应血清型的疫苗免疫。有条件的猪场可以采集本猪场的病料做自家苗。种猪用副猪嗜血杆菌多价灭活苗免疫能有效防止仔猪早期发病，降低复发的可能性。免疫的同时最好结合科学的药物治疗，达到标本兼治的功效。初免母猪产前40 d一免，产前20 d二免。经免母猪产前30 d免疫1次即可。受本病严重威胁的猪场，仔猪也要进行免疫，根据猪场发病日龄推断免疫时间，仔猪免疫一般安排在7～30日龄内进行，每次1 mL，最好一免后过15 d再重复免疫1次，二免距易发病日龄要间隔10 d以上。

2.3 治疗

发病猪采用头孢噻呋钠5 mg·kg-1体重，2%黄芪多糖0.2 mg·kg-1体重，混合肌肉注射；20%氟苯尼考0.05 mg·kg-1体重，中药制剂（金银花、黄芩、连翘提取物）0.2 mg·kg-1体重，分别肌肉注射。猪群在日粮中加入阿莫西林400 g·t-1，5%普乐健1 kg·t-1，金霉素2 kg·t-1，连喂7 d，停3 d，再加喂3 d。或任选泰妙菌素50～100 mg·kg-1，氟甲砜霉素50～100 mg·kg-1，利高霉素44～1000 mg·kg-1，泰乐菌素、磺胺二甲嘧啶各100 mg·kg-1，林可霉素200 mg·kg-1，环丙沙星 150 mg·kg-1等 1～2 种药物拌料。当出现Hps感染时，将猪舍内所有病猪隔离，淘汰无饲养价值的僵猪或严重病猪；将猪舍冲洗干净，严格消毒，改善猪舍通风条件，疏散猪群，减少密度，严禁混养。

3 小 结

近年来，Hps引起的危害日趋严重，对于该病的诊断通常依赖于猪群发病史、临床症状、病理变化和细菌分离、检测等做出诊断。与传统诊断方法相比，近年来新引入的各种灵敏度高、专属性强的实验室检测方法，使该病的诊断更加客观和迅速。但是仍有许多问题尚未解决，例如许多分离株的血清型还不能分类定型，Hps感染的分子基础也不十分清楚，在实践中PCR和Southern blot方法的应用也存在困难，仍需要研究人员进一步的研究探讨，从而寻找到一种更好的诊断治疗方法。

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