小G蛋白Rab40a的亚细胞定位及功能研究

张 蕾，常 宏，徐 东

（1.首都医科大学宣武医院心脏中心，北京100053；2.河北医科大学基础课教学部生物化学教研室，河北石家庄050091）

·论 著·

小G蛋白Rab40a的亚细胞定位及功能研究

张 蕾1，常 宏2*，徐 东1

（1.首都医科大学宣武医院心脏中心，北京100053；2.河北医科大学基础课教学部生物化学教研室，河北石家庄050091）

目的研究小G蛋白Rab40a的亚细胞定位及参与的细胞内囊泡运输路径。方法应用共聚焦显微镜技术，研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的Rab40a在Hela细胞内与各种亚细胞结构，特别是转运囊泡的共定位。利用RNA沉默技术研究Rab40a可能参与的细胞内囊泡转运过程。结果Rab40a与高尔基标记蛋白Golgin-97、内吞体标记蛋白EEA1存在共定位；干扰Rab40a表达明显阻断了霍乱毒素B自内吞体向高尔基体的转运。结论Rab40a定位于细胞内吞体和高尔基体，参与细胞内内吞体到高尔基体之间的转运。

GTP结合蛋白类；脂质体；RNA干扰

真核细胞各细胞器之间通过囊泡运输和微管系统进行物质的交换和信息传递，从而调节细胞的生长、发育、分裂及细胞与细胞间的物质交换。小G蛋白，包括Ras、Raf、Arf、Rho和Rab等广泛参与这一过程。其中最大的亚家族，Rab家族目前已确定的成员超过60个，在囊泡的形成、转运、黏附、锚定和融合等过程中起重要作用［1－3］。在本实验室另一项关于GPR30的研究中，我们发现Rab40a与GPR30相互作用。而人Rab40a的功能却未见报道。为此，我们利用共聚焦显微镜和RNA沉默技术，寻找RAB40a可能参与的细胞内囊泡运输路径。

1 材料与方法

1．1 材料：大肠杆菌JM109购自Promega公司，为河北医科大学基础课教学部生物化学研究室保存。DNA重组所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR相关试剂，胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自TAKARA公司。细胞培养用DMEM培养基及胎牛血清，转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen。引物合成及测序由华大基因公司完成。兔抗GFP多克隆抗体，鼠抗人EEA1，Rab5，Rab11单克隆抗体购自Santa Cruz公司。鼠抗人Golgin-97单克隆抗体，HRP-羊抗兔抗体，Alexa594-羊抗鼠抗体，Mitotracker，Lysotracker购自Invitrogen。

1．2 方法

1．2．1 GFP-Rab40a重组质粒的构建与鉴定：根据Rab40a（NM-080879）编码序列合成上下游引物并引入合适的酶切位点和保护碱基，引物为Rab40a-F（5′-CGGAATTCGATGTGAGCGCCCCGGGCAGC-3′）和Rab40a-R（5′-CGGGATCCTTAAGAAATTTTGCAGCT-3′），下划线处分别为EcoRI和BamHI酶切位点。PCR扩增Rab40a全长，PCR产物经回收与eGFP-C1载体同时用EcoRI与BamHI双酶切，酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接，重组质粒GFPRab40a以测序鉴定。

1．2．2 Western Blot检测：GFP-Rab40a转染的Hela细胞，24h后以去污裂解液裂解细胞。取20μg蛋白上样进行10％SDS-PAGE电泳。转膜后，封闭（TBS＋5％脱脂奶粉），加一抗GFP（1∶2 000），二抗HRP-羊抗兔抗体（1∶10 000），洗膜后X线片曝光。

1．2．3 细胞培养与质粒转染：Hela细胞在放入24孔板的玻片上进行培养达70％～90％融合。在25μL无血清DMEM培养基中加入0.5μg质粒，在另一管25μL无血清DMEM培养基中加入lipofectamine 2000 1μL，5min后，将两管混合置于室温，20min后加入细胞培养液中。24h后取出玻片，进行免疫荧光染色。

1．2．4 免疫荧光染色：细胞经4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3遍去掉多余的多聚甲醛，加入封闭液（10％马血清＋PBS）封闭1h，加入一抗室温1h，PBS洗3遍，然后加入荧光二抗，室温0.5h，PBS洗3遍后在共聚焦显微镜下观察。

1．2．5 RNA沉默和脉冲追踪（pulse and chase）：将干扰RNA以无菌水稀释至终浓度20μmol/L。Hela细胞在放入24孔板的玻片上进行培养达50％～70％融合。在25μL无血清DMEM培养基中加入1μL干扰RNA，在另一管25μL无血清DMEM培养基中加入lipofectamine 2000 2μL，5min后，将两管混合置于室温，20min后加入细胞培养液中。24h后细胞分离传代，再过48h后，加入Alexa 594-标记的霍乱毒素B（5mg/L）或Alexa 594-标记转铁蛋白（30mg/L），冰上30min，换培养液洗3遍，加入10倍浓度的无标记的霍乱毒素B或转铁蛋白，37C 30min，取出玻片，进行免疫荧光染色。RNA沉默的效果以RT-PCR进行检测，引物为Rab40a-F（5′-GGGGATCGACTACAAGACGACC-3′）和Rab40a-R（5′-AGGTGT-GCAGGACACG-3′）。

2 结 果

2．1 重组质粒的构建与鉴定：重组质粒经EcoRI与 BamHI酶切，有约830bp片段插入。测序表明插入片段与Rab40a开放阅读框序列完全相符，无碱基突变和缺失，插入方向正确，未发生读码框架改变。

2．2 Western Blot检测GFP-Rab40a在Hela细胞内的表达：利用GFP抗体检测显示，在转染GFPRab40a的细胞内，有一条约50 000条带，符合预测的融合蛋白相对分子质量大小，而未转染的细胞无此条带。

2．3 GFP-Rab40a的细胞内定位：GFP-Rab40a转染的Hela细胞，用多聚甲醛固定，Triton X-100打孔，进行免疫荧光染色。结果发现，Rab40a与高尔基标记蛋白Golgin-97、内吞体标记蛋白EEA1存在共定位。而其他细胞器标记蛋白（线粒体，溶酶体，内质网）不与Rab40a共定位（图1）。进一步研究发现，Rab40a与Rab5a、Rab11a存在共定位，提示其功能可能与内吞体转运相关（图2）。

2．4 Rab40a沉默对细胞内物质运输的影响：RTPCR显示，转染Rab40a干扰RNA的Hela细胞较转染对照无功能小RNA的细胞，Rab40a表达明显降低。转铁蛋白的脉冲追踪（pulse-chase）实验显示，干扰Rab40a表达并不对转铁蛋白在细胞内的运输产生明显影响。细胞膜上的转铁蛋白经过30min脉冲追踪，在对照组与Rab40a干扰组，均到达微管组织中心，即循环内吞体集中区域。而霍乱毒素B的脉冲追踪实验表明，干扰Rab40a表达明显阻断了霍乱毒素B自内吞体向高尔基体的转运，在30min后，干扰组的霍乱毒素B仍散在分布于内吞体，而对照组已集中在高尔基体（图3）。

3 讨 论

Rab蛋白家族中，Rab40a的功能尚未见报道。已进行功能研究的Rab家族成员，均特异地参与细胞内囊泡运输的不同阶段，如Rab1参与新合成蛋白由内质网到高尔基体的转运［4］，而Rab5、Rab4、Rab11组成质膜→早期内吞体→循环内吞体→质膜运输路径［5］。在寻找可能与Rab40存在共定位的蛋白过程中，我们首先发现了早期内吞体标记蛋白EEA1，这提示Rab40a参与早期内吞体的运输。但是，早期内吞体囊泡内的蛋白，会经历不同的命运。一部分会经由循环内吞体重新转运到细胞膜上，如转铁蛋白受体；一部分会演变为晚期内吞体→溶酶体，蛋白最终被水解，如生长因子受体；还有一部分会被运送至高尔基体，如霍乱毒素［6－7］。而自高尔基体出芽生成的囊泡，也会被转运至内吞体，如CIMPR与CD-MPR［8］。

由于Rab40a与高尔基体蛋白Golgin-97也存在部分共定位，因此我们重点比较了Rab40a对内吞体→细胞膜与内吞体→高尔基体2种路径的影响。结果表明，Rab40a不参与内吞体→细胞膜路径蛋白运输，而是参与了内吞体→高尔基体路径。有报道Rab11也参与了这一途径，这与我们发现Rab40a与Rab11存在共定位相吻合［9］。需要指出的是，Rab40a尚无系统的研究报道，所以商品化的抗体尚未面世。我们目前的研究，是以GFP融合蛋白示踪Rab40a的细胞内分布。这一方法在Rab家族蛋白的研究中被广泛应用。但亦有报道指出个别Rab蛋白，其内源分子与过表达分子的细胞定位存在较大差异［10］。因此，Rab40a抗体的制备，对将来进一步阐明RAab40a的生物学功能至关重要。由于Rab蛋白功能损伤或基因突变会导致很多疾病，如免疫缺陷、癌症以及神经紊乱［11］，故阐明每一个Rab蛋白在细胞内确切参与的运输路径，对认识这些疾病的病理过程有重要意义。（本文图见封三）

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（本文编辑：刘斯静）

SUBCELLAR LOCALIZATION AND FUNCTIONAL STUDY OF SMALL GTPase Rab40a

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1．Department of Cardiology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China；2．Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

Objective To study the subcellular localization and intracellular vesicle transport pathway which small GTPase Rab40a is involved in.MethodsThe colocalization of green fluorescent protein（GFP）labeled Rab40a with subcellular structures，especially transport vesicles in Hela cellswas observed by confocal microscopy.The intracellular vesicular transport pathways which Rab40a may be involved in was studied by using RNA silencing technology.ResultsRab40a was colocalized with endosome and Golgimarker proteins，EEA1 and Golgin-97.Interfering Rab40a blocked the transportation of cholera toxin B from endosome to Golgi.ConclusionRab40a is localized in endosome and Golgi and participates intracellular transport from endosome to Golgi.

GTP-binding proteins；liposomes；RNA interference

R341

A

1007-3205（2013）05-0512-03

2013－02－25；

2013－04－02

张蕾（1974－），女，湖北武汉人，首都医科大学宣武医院主治医师，医学硕士，从事影像学及细胞生物学诊断研究。

*通讯作者。E-mail：ch720321＠126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.006