血液细胞分析技术的临床应用与研究进展

庞 博 刘贵建

(中国中医科学院广安门医院检验科，北京100053)

血液细胞分析是对包括血液病在内的多种疾病进行诊断与鉴别诊断的重要手段。传统的血液细胞分析主要依靠显微镜检查，随着分子生物学、免疫学等生命科学的发展，越来越多的疾病标志物与免疫表型标志物不断涌现，使得通过分子标志物对细胞进行识别、分类成为可能。而现代自动化仪器的技术和检测方法也在快速进步，这促使血细胞的自动化分析在临床上有了较为普遍的应用。

近年来，全自动血细胞分析仪已经在临床实验室普遍使用，流式细胞仪在一些大型教学医院、综合性医院也开始较多的使用，血液数字化图像分析设备也开始进入临床实验室。新的血液细胞检验技术仍在不断涌现，自动化、流水线化、数字化与图像化成为其主要发展趋势。本文现对血液细胞分析技术的临床应用和进展进行简要综述。

1 全自动血细胞分析仪的应用与进展

20世纪中叶，库尔特以电阻率变化为基础研制了性能较稳定的血细胞计数仪，这为临床血细胞分析步入自动化时代揭开了序幕。时至今日，全自动血细胞分析仪已在临床上有了较为普遍的应用，其检测技术更为先进，检验项目更为丰富，呈现出功能多样化、流水线化的特点。

1)多种检测技术联合应用:在血细胞自动分析仪的应用早期，主要依靠单一的电阻法技术，可将细胞进行基本识别与分群，如白细胞可通过体积分布直方图分为淋巴细胞群、粒细胞群和中间细胞群3个部分。中间细胞群包括了嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞等，尚不能通过单一阻抗技术进行区分，因而仅能实现白细胞的二分类或三分类。20世纪90年代后，一些五分类仪器得到临床应用，这些仪器有不同的技术组合形式，如采用电阻法联合高频电导和激光散射，电阻法联合荧光染色和激光散射，细胞化学染色联合激光散射，多角度偏振光散射法等技术方法。不同技术的特点各不相同，如高频电导是针对细胞核质比例等内部特征进行分析，激光散射则可分析细胞内性质不同的颗粒，荧光染色可以反映细胞内核酸物质的多少。不同种类白细胞内含过氧化物酶的量不同，对其进行细胞化学染色可以实现将其区分的目的。这些技术的组合应用，可探测细胞的多种特征，从而实现了较为细致的分类。

2)优化技术弥补不足:自动化仪器大大节约了人工涂片计数分类所耗费的时间与精力，但也存在一些不足。由于红细胞(red blood cell，RBC)与血小板(platelet，PLT)的测量信号存在交叉，大的PLT会被误认为是RBC，而小的RBC则会进行PLT通道参与计数，造成计数误差。研究者们已将技术不断优化，以弥补这种不足。如二维光折射法可通过细胞体积和折射系数二维参数计数PLT，可以区分出PLT、小RBC、RBC碎片、RBC残骸及电子噪音，在一定程度上提高了PLT计数的准确性。有的仪器加用了标记荧光的单抗簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)61以促进对血小板的识别。此外，还有扫流技术、防反流装置、鞘流技术、浮动界标技术以及延时计数、拟合曲线等技术，也可以提高细胞计数的准确性。

3)检测参数不断丰富:目前，全自动血细胞分析仪也在不断增加新的检测功能，例如有的仪器增加了对网织红细胞的识别功能，有的则增加了对幼稚细胞和有核红细胞的分析，还有的仪器增加了流式细胞仪的功能，可以进行CD4、CD8、CD3的测定，因而实现了对淋巴细胞亚群的分型［1］。尽管这类全自动血细胞分析仪尚未在临床上普遍应用，但反映出了其功能扩展化的趋势，同时也应注意到临床上对于血细胞分类进一步细化的需求越来越高［2］。

4)血液细胞分析的流水线化:近年来，血细胞分析仪逐渐发展成为全自动流水线，不仅包括血液常规自动化分析，而且通过自动制片机实现了血片的制备，样本筛选、涂片、编号、染色、干燥等一系列步骤均由机器自动完成。根据常规检测数据和直方图的结果，仪器首先按照规则决定是否需要进一步镜检，根据红细胞情况决定是否需要网织红细胞计数，根据红细胞压积来决定涂片的角度和厚度，从而将人工筛选、涂片的过程自动化，使整个流程和操作趋向标准化［3］。

5)全自动血细胞分析仪存在的缺陷:尽管全自动血细胞分析仪在技术上已经有了很大进步，但仍有一些缺点尚未解决。如对于有核红细胞、中性粒细胞的中毒颗粒、异型淋巴细胞、血小板聚集的卫星现象可能存在一定的识别困难。有的仪器虽具备异常细胞识别与报警能力，但往往其敏感性过高，很难达到理想的预期效果。同时单靠仪器也难以实现对球形红细胞、点彩红细胞、泪滴样红细胞、呈缗钱样排列红细胞等特殊形状红细胞的类型辨别。因此，为了获得最为准确的信息，应充分认识到自动化技术的局限性，制定合理的复检规则，将血细胞自动分析仪与人工镜检结合起来。

2 流式细胞术的应用与进展

流式细胞术最早源于20世纪60年代后期的斯坦福大学，并在随后对获得性免疫缺陷综合征患者的诊疗中得到认可。发展至今，流式细胞术的用途得到了广泛的扩展，已成为临床实验室较为常用的技术之一［4－5］。简单地说，流式细胞术的原理就是把经荧光染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液，在鞘液的帮助下逐个排列，经激光检测区受其激发，产生散射光和荧光信号，经光电倍增管和探测器转变为电脉冲，进入计算机，以各种参数的方式显示出来，再利用软件进行分析。

1)流式细胞术在血细胞计数分类上的临床应用:流式原理对血细胞进行技术与分型具有许多优势，其分析速度快，检测指标多，且可以将项目灵活组合，在多个临床领域发挥着重要作用。在免疫学方面，可通过对不同CD分子的检测来鉴定不同的免疫细胞类型，明确其所占比例，也可同时通过对细胞因子的检测来了解不同免疫细胞的功能状态，从而推测出患者所处的不同免疫状态［6］。因此，流式细胞术对于多种免疫相关疾病均有着重要的应用价值。在血液病方面，通过对其独特抗原的分析，可对急性白血病、淋巴瘤进行诊断，这对于那些通过形态学检查难以得出结论的患者来说尤为重要［7］。也可通过该技术检测微小残留病变，以了解白血病患者病情，及时采取措施避免复发［8］。此外，该技术还可对血小板功能进行检测，对胞内蛋白进行分析，计数网织红细胞，通过监测外周血或干细胞采集物中干细胞的含量来了解造血干细胞移植患者免疫重建的状况。

2)流式细胞术的多色应用与可视化发展趋势:近年来，9色或10色等多色流式细胞术的应用逐渐增加，其主要是针对白血病和淋巴瘤患者进行诊断和病情监测［9－10］。多色流式细胞术的优势在于可以实现对细胞群进行更为精确的鉴定，仅使用少量样本便可获取该细胞群的详细信息，大大提高实验室工作效率，对少量异常细胞群实现持续监测［10］。

普通的流式细胞术仅能对模拟信号进行分析，无法直接观察到细胞的形态和结构，无法实现细胞内的荧光信号定位。研究者为了克服这些缺点，研发了可视流式细胞分析仪，也称为显微成像流式细胞仪。它能够为每个细胞生成12张图片，以反映其真实影像。在图片中能够区分荧光在细胞质、细胞膜和细胞核的定位。点击散点图中的每个点或直方图中的信号点，便可观察到相应的细胞图片。此外，使用者可以在FlowSight中观察所设门内外的细胞图片，以此确认设门是否准确。这种可视功能无疑将大大拓展流式细胞术的分析能力，在一定程度上避免了设门不当导致的计数分类错误。

3 血细胞自动数字图像分析

为了最大限度地将血细胞分析工作自动化、标准化和直观化，人们又开发了可将细胞形态直接显示在屏幕上的自动血细胞数字图像分析系统。该系统是基于自动模式进行识别的神经网络分析方法运行的，它可以实现自动涂片、染色，并将100～200个白细胞进行预分类计数，将这些白细胞全部显示于显示屏上，十分简便、快捷，且有利于标准化的实现。尤其对于异常形状的白细胞、原始细胞和幼稚细胞的分类十分有益，也便于观察红细胞、血小板的形态，检查寄生虫感染情况等。Cornet等［11］的研究发现，对于多种血液学参数，DM96与人工镜检的一致性可达98%。可用于急慢性白血病的辅助诊断。Ceelie等［12］的研究则发现，DM96系统识别分叶核中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞以及幼稚细胞与人工镜检的一致性分别为98.6%、93.5%、84.7%、95.2%、94.0%、78.5%，而杆状核中性粒细胞的一致性较差，为22.9%。在分析时间方面，该研究也对不同自动形态分析仪进行了比较，Octavia系统和DM96系统对每张涂片进行100个白细胞的分析，平均耗时分别为5.4 min和3.2 min，而研究中较为熟练的人工操作则平均需要约4 min 的时间［12］。

自动数字图像分析技术节约了实验室工作人员的时间，便于教学和远程读片会诊［13］。可以将这种血细胞自动数字图像分析工作系统纳入到血液细胞自动分析的流水线中，使得整个流程更为合理、便捷和标准化，这是未来现代化临床实验室的一种理想模式。应注意的是，这种数字图像分析系统仅是一种预分类方法，人工确认仍是保证准确诊断的不可缺少的重要环节。自动化与可视化技术的目的并非为了以机器分类替代人工识别，而是提高了涂片效率，增加了预筛选步骤，为读片工作节约了更多的时间。

总之，可以预见，新的技术还会不断涌现，血液细胞的分析工作将会变得更为便捷、准确。自动化、流水线化、可视性增强使得人工操作繁琐费时的状态得到进一步改善。对血细胞表面或内部标志物的分析，可以使其分类得到进一步细化，以分子分型实现了传统人工镜检所不能做到的分类方式，同时还可以对特定类型血细胞的功能进行了解。但同时也应注意，无论技术怎样发展，自动化分析仪器总有其内在不足，人工镜检是血液细胞分析中的重要部分，具有自动仪器检测所不能替代的直观、实用和经济优势。不断发展的自动化分析技术与传统的人工镜检相互结合，才会真正更加有利于对疾病的准确诊断和对病情的合理判断。

［1］Briggs C.Quality counts:new parameters in blood cell counting［J］.Int J Lab Hematol，2009，31(3):277－297.

［2］Mittag A，Tarnok A.Recent advances in cytometry applications:preclinical，clinical，and cell biology［J］.Methods Cell Biol，2011，103:1－20.

［3］Bär H，Hochstrasser R，Papenfub B.SiLA:Basic standards for rapid integration in laboratory automation［J］.J Lab Autom，2012，17(2):86－95.

［4］Herzenberg L A，Parks D，Sahaf B，et al.The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry:a view from Stanford［J］.Clin Chem，2002，48(10):1819－1827.

［5］Brown M，Wittwer C.Flow cytometry:principles and clinical applications in hematology［J］.Clin Chem，2000，46(8 Pt 2):1221－1229.

［6］Zola H，Swart B，Nicholson I，et al.CD molecules 2005:human cell differentiation molecules［J］.Blood，2005，106(9):3123－3126.

［7］Di Noto R，Mirabelli P，Del Vecchio L.Flow cytometry analysis of acute promyelocytic leukemia:the power of‘surface hematology’［J］.Leukemia，2007，21(1):4－8.

［8］Walter R B，Gooley T A，Wood B L，et al.Impact of pretransplantation minimal residual disease，as detected by multiparametric flow cytometry，on outcome of myeloablative hematopoietic cell transplantation for acute myeloid leukemia［J］.J Clin Oncol，2011，29(9):1190－1197.

［9］Will B，Steidl U.Multi－parameter fluorescence－activated cell sorting and analysis of stem and progenitor cells in myeloid malignancies［J］.Best Pract Res Clin Haematol，2010，23(3):391－401.

［10］Wood B.9－color and 10－color flow cytometry in the clinical laboratory［J］.Arch Pathol Lab Med，2006，130(5):680－690.

［11］Cornet E，Perol J P，Troussard X.Performance evaluation and relevance of the CellaVision DM96 system in routine analysis and in patients with malignant hematological diseases［J］.Int J Lab Hematol，2008，30(6):536－542.

［12］Ceelie H，Dinkelaar R B，van Gelder W.Examination of peripheral blood films using automated microscopy:evaluation of Diffmaster Octavia and Cellavision DM96［J］.J Clin Pathol，2007，60(1):72－79.

［13］Rollins－Raval M A，Raval J S，Contis L.Experience with CellaVision DM96 for peripheral blood differentials in a large multi－center academic hospital system［J］.J Pathol Inform，2012，3:29.