用薄层扫描法测定油茶粕蛋白水解物的多肽

朱 培 ，钟海雁 ，2，黄卫文 ，周 波 ，龚吉军 ，赵清洁

（1.中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

目前，多肽的测定方法包括柱前衍生反相高效液相色谱法、氨基酸自动分析联用法、差减法、电化学法以及电泳法[1-3]。其中，差减法、电化学法和电泳法测定多肽总量，无法确定多肽的种类；液相色谱质谱联用仪在测定多肽类化合物方面具有分离度好、灵敏度高、可进行结构鉴定等优点，但是该法对样品的前处理要求高，时间长[4-5]。

薄层扫描法（TLC）也称薄层光密度法，是薄层色谱技术与光扫描仪和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。薄层扫描法对于样品的前处理要求较低，并可同时对各种复杂的样品进行分离和测定[6]。薄层扫描法多应用于蛋白质和氨基酸的测量中，对于多肽的测量未见报道[7]。蛋白水解物因水解度的不同，样品液中多肽的种类和含量也会不相同[8]，因此，测定多肽常用的高效液相色谱法则不能快速测定复杂多肽的含量，在多肽的企业化生产中使用有一定的局限性[9]。薄层扫描法可以对同一类物质进行测定，无需高度分离和纯化。所以，用薄层扫描法测定蛋白水解物中的多肽的含量，在企业化生产中具有重要的意义。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

低温冷榨粕采购于湖北通程；菌种由中南林业科技大学食品科学与工程学院自行筛选。

中草药粉碎机：FW135型，天津泰斯特仪器有限公司。紫外分光光度计：UV1800，日本岛津公司。薄层扫描仪：KH-3100型，上海科哲生化科技有限公司。高效液相色谱仪：Prominence LC-20A，日本岛津公司。

还原型谷胱甘肽标准品：购于上海源叶生物科技有限公司。显色剂：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中[10]；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 样品液的配制

发酵条件：时间：5.14 d、接种量：10.16‰、温度：31.71 ℃，进行固态发酵，低温烘干至恒重，取发酵料10.00 g用蒸馏水在常温下溶解、离心、定容100 mL；并用未发酵的原料做对照。

1.2.2 谷胱甘肽标准溶液的制备

准确称取100.00 mg还原型谷胱甘肽标准品，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准液。取10 mL上述标准液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配成0.1 mg/mL的标准液备用。

1.2.3 色谱条件

薄层色谱：薄层板为硅胶G预制板；上行法展开15 cm；挥干溶剂，喷茚三酮显色剂，在105 ℃加热10～15 min[11]。

反向高效液相色谱条件：检测波长230 nm；柱温30 ℃；流速1.50 mL/min；上样量25 μL；色谱柱C18柱（5.00 μm×25.00 cm× 4.60 mm）。

流动相A为乙腈；流动相B为水。

洗脱梯度：0～5 min，80%→10% A，维持10 min；15～20 min，10%→80% A。

2 结果与分析

2.1 展开剂的确定

发酵液中，除多肽外还存在一些氨基酸和小分子量蛋白质。为获得多肽的最佳分离效果，需对层析展开剂进行选择[12]。不同展开剂对蛋白水解物分离效果见表1，由表1可知，正丁醇＋乙酸＋水（体积比为4∶1∶1）的展开剂对多肽的分离效果较好，不仅层析斑点的比移值（Rf）值较大，斑点之间的Rf值差距也较大，而且斑点清晰。而其他展开剂均不利于多肽的分离，选正丁醇＋乙醇＋水（体积比为4∶1∶1）作为展开剂。

表1 不同展开剂对蛋白水解物的分离效果Table 1 Effect of different developing agents on separation of protolysate

2.2 扫描波长的确定

分别对还原型谷胱甘肽标准溶液、发酵溶液以及原料进行全波段扫描，在波长为231 nm附近，谷胱甘肽标准溶液、发酵溶液以及原料溶液有最大吸光度。因此，可选231 nm为谷胱甘肽和发酵水解液中多肽的测定波长。

2.3 发酵液的薄层层析

分别对未发酵的原料、发酵水解液和不同质量浓度的谷胱甘肽进行层析展开，结果如图1所示。

由图1可知，点样的3种不同的还原型谷胱甘肽标准液，只有1 mg/mL的标准品在图谱上显出了斑点，0.1 mg/mL的谷胱甘肽标准品不能在硅胶板上成像。这可能是由于标准品经过展开剂稀释后，浓度过低未能达到TLC的检测线。因此，得出的结论是：采用薄层扫描法测定多肽的最低质量浓度为1 mg/mL。

2.4 扫描结果

样品扫描结果如表2所示。由表2可知：依据面积积分值和1 mg/mL的还原型谷胱甘肽标准品的面积对比，可得原料溶液中多肽含量为0.89mg/mL；发酵液多肽含量为1.82 mg/mL。

图1 薄层薄板成像Fig.1 Thin layer plate chromatography

表2 样品扫描结果Table 2 Scanning results of samples

2.5 重复性试验

对1 mg/mL谷胱甘肽标准品进行5次重复测定，结果见表3。变异系数（RSD）＜5%，说明采用薄层扫描法测定多肽含量，精密度高、重复性好[13]。

表3 重复性试验结果Table 3 Repetition test result

2.6 回收试验

为了检验该方法的准确性，点样2 µL油茶粕固态发酵液，同时加入2 µL谷胱甘肽标准液，以测定发酵液中的多肽含量，结果如表4。5次测得的平均回收率为106.94%，标准偏差为0.058%。因此，该法准确性较高。

表4 回收试验结果Table 4 Recovery result

2.7 与反向高效液相色谱法测定结果比较

本试验选取发酵液样品，谷胱甘肽为标准品，分别用上述的方法与反向高效液相色谱法测定其多肽含量[14-15]，并做3次平行试验。结果见表5。薄层扫描法和反向高效色谱法测定结果由SPASS软件分析得：薄层扫描法测定多肽含量均值为1.81 mg/mL，相对误差为1.76%；而高效液相色谱法测定多肽含量均值为2.17 mg/mL，相对误差为0.82%。独立样本T检验结果：P＝0.283＞0.05，两者无显著性差异。而且薄层扫描法测定油茶粕蛋白水解物多肽所需设备简单，样品无需前处理、操作方法简便，对于标准样品的要求较低。薄层扫描法相对于反向高效液相色谱在测定油茶粕蛋白水解物多肽方面具有一定的优势。

表5 薄层扫描法与反向高效液相色谱法测定结果的对比Table 5 Comparison of determined results by TLC and RP-HPLC

3 结论与讨论

本研究建立的TLC检测油茶粕固态发酵蛋白水解物中多肽含量的方法，重复性标准偏差为0.03%；回收试验的平均回收率为106.94%，且标准偏差为0.058%。并且与高效液相色谱法进行的对比，其结果无显著性差异。

薄层扫描法测定油茶粕固态发酵蛋白水解物中多肽的含量具有一定的可行性，在确定展开剂及描述波长的基础上，测定了该方法的重复性、加样回收率。结果表明：以谷胱甘肽为对照品与油茶粕发酵液多肽进行薄层分离，其TLC的重现性和加样回收率等均符合含量测定要求；发酵液中多肽为1.82 mg/mL比原料液中的0.89 mg/mL约增加了1倍。

因此，采用薄层扫描法测定油茶粕蛋白水解物多肽具有灵敏、准确、简便等优点，可以作为企业中快速检测多肽的方法之一。研究结果为油茶饼粕蛋白及其活性成分的利用[16-19]提供可借鉴的方法。

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