盐酸米托蒽醌诱导人鼻咽癌细胞CNE—2凋亡的研究

王炜　刘斌　童春义　程小广　陈稚　赵毅　胡新荣

[摘要] 目的 探讨盐酸米托蒽醌诱导人鼻咽癌细胞CNE-2凋亡作用和机制。 方法 用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测盐酸米托蒽醌对CNE-2细胞生长的抑制作用，流式细胞仪检测细胞内药物积聚量与细胞凋亡率之间的关系，共聚焦检测盐酸米托蒽醌在细胞中的定位。 结果 盐酸米托蒽醌对CNE-2细胞生长具有抑制作用，呈时间和剂量依赖性，并能有效诱导细胞凋亡，其在细胞中主要以斑点形式分布在细胞质中。 结论 盐酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌细胞CNE-2细胞生长，并诱导细胞凋亡，CNE-2细胞的药物敏感性与药物在细胞内的分布位置有直接关系。

[关键词] 盐酸米托蒽醌；鼻咽癌；生长抑制；凋亡

[中图分类号] R739 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）01（b）-0015-02

鼻咽癌是亚洲常见的头颈部恶性肿瘤之一，目前临床上治疗手段以放疗为主，5年总生存率为59%～75%[1-2]。多项研究均证实，对复发或转移的鼻咽癌，同步放、化疗可使总生存率提高8%～30%[3-4]，但此方法的最佳组合模式和新化疗药物的疗效尚有待明确。盐酸米托蒽醌是一种细胞周期非特异性的蒽环类抗肿瘤药物，结构与阿霉素相似，能抑制DNA和RNA合成，心脏毒性小，主要用于恶性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病，对肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和头颈部癌也有一定疗效[5]。目前有关盐酸米托蒽醌对鼻咽癌作用效果及其机制研究少见报道，该实验拟通过观察盐酸米托蒽醌在体外条件下对人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2细胞生长增殖及凋亡的影响，并对机制进行初步探讨，以证实其在鼻咽癌治疗中的可能应用前景。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞由本实验室自建，盐酸米托蒽醌购于江苏南通精华制药有限公司， DEME培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，CCK-8细胞中增殖和细胞毒性检测试剂盒购自江苏碧云天生物科技研究所，PI（碘化丙啶）购于Sigma公司。

1.2 细胞培养与药物处理

取对数生长期的CNE-2细胞以106 mL浓度接种于含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DEME培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养瓶壁贴满细胞时，加入盐酸米托蒽醌注射液，使样品的药物浓度分别为0.1、0.5、1、1.5、 2 μg/mL 。

1.3 CCK-8细胞中增殖和细胞毒性检测试剂盒检测

对数生长期的CNE-2细胞制成细胞悬液，接种于96孔板内，每孔2×103个细胞，体积为100μL/孔，设阴性对照组和空白对照组。其余细胞三孔为1组，培养24 h后每孔加入不同浓度的盐酸米托蒽醌继续培养24、48 h后，每孔加CCK-8试剂10 μL， 继续培养1 h后，在酶标仪上检测样品450 nm处吸光度OD值，计算细胞增殖率，细胞增殖率=（药物处理孔的 OD 值-空白对照孔的 OD 值）/（阴性对照孔的 OD 值-空白对照孔的 OD 值） ×100%。

1.4 流式细胞术测定细胞内药物浓度

取对数生长期CNE-2细胞，不同浓度盐酸米托蒽醌培养2 h后，弃上清，PBS洗1次，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，PBS洗2次后，加入1 mL 4 ℃预冷PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测细胞内盐酸米托蒽醌的荧光强度。（盐酸米托蒽醌激发光谱630～650 nm，发射光谱685 nm）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

药物处理24 h后的细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗涤细胞2次，2 000 rpm离心5 min收集5×105细胞，加入500 L的Binding Buffer悬浮细胞后，加入5 L Annexin V-FITC混匀，再加入5L PI混匀，室温避光反应15 min后上流式细胞仪的检测。

1.6 共聚焦检测细胞内药物定位情况

对数生长期CNE-2细胞接种于共聚焦培养小皿内24 h后，加入1 μg/mL药物处理1 h后，弃去培养基，PBS洗涤两次后，将细胞与共聚焦显微镜下检测细胞内盐酸米托蒽醌的荧光强度和定位情况。

1.7 统计方法

采用SPSS17.0软件进行分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，进行t检验。

2 结果

2.1 盐酸米托蒽醌对CNE-2细胞增殖的抑制作用

不同浓度的米托蒽醌分别作用于人鼻咽癌CNE-2细胞24 h和48 h，CCK-8法检测它的增殖抑制效果。结果表明（见表1）：当时间不变时，随着盐酸米托蒽醌剂量的增大，对CNE-2细胞抑制作用增强，且呈剂量依赖性；在同一药物浓度情况下，随着药物作用时间的延长，药物对细胞株增殖的抑制作用也有所增强，呈时间依赖性。盐酸米托蒽醌作用48 h后，1.5-2.0μg/mL各组的细胞增殖抑制率均超过80%。盐酸米托蒽醌分别处理细胞24、48 h，其24 h和48 h半抑制浓度IC50值分别为1.89、0.098μg/mL。选择24 h作为后续研究的作用时间。

3 讨论

盐酸米托蒽醌是一种抗肿瘤药物，据文献报道微克级浓度可抑制细胞增殖，亚毫克级浓度可使CHO、FL、SGC-7901等细胞株克隆形成能力下降[6]。在临床上，其广泛应用于肿瘤的治疗，但鲜见关于盐酸米托蒽醌用于鼻咽癌治疗和作用机制的报道。

该研究结果显示，盐酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌细胞的生长和诱导细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖性。形态学观察发现，低于1 μg/mL浓度盐酸米托蒽醌作用的细胞6 h内无明显变化，药物浓度大于1 μg/mL作用细胞6 h后，有细胞开始变形，细胞膜皱缩，呈现坏死的形态。流式结果显示，药物浓度0～1 μg/mL范围内，细胞对于药物的内吞药物量与作用浓度成正比，当药物浓度大于1.5 μg/mL时候，细胞的内吞药物量并没有明显变化，说明由于细胞自身耐药蛋白的外排作用，使高浓度药物并不能有效的进入细胞的内部引起细胞程序性凋亡，而是通过药物的毒性直接引起细胞坏死。

共聚焦显微镜结果显示，盐酸米托蒽醌的红色的荧光明亮，主要以斑点状分布于细胞质内，少量分布于细胞核。米托蒽醌药物的细胞内定位与细胞的药物敏感性有着密切的关联，有研究显示[7]在两种对米托蒽醌敏感程度不同的乳腺癌细胞系中，较为敏感的细胞中的药物荧光更亮且呈斑点状分布于细胞质和细胞核中。复合纳米粒的药物通过增加乳腺癌细胞对盐酸米托蒽醌的摄取量，使细胞内药物浓度增加而增强细胞的药物敏感性[8]。

对于临床的鼻咽癌治疗，新的敏感化疗药物的选用一直是研究的热点。盐酸米托蒽醌属于用于其他肿瘤化疗的成熟药物，如能有效的治疗鼻咽癌，将能省去漫长的临床试验过程，且研究显示药物的细胞内浓度和定位与细胞的药物敏感性有直接的联系，应用此方法可以首先在体外对病人是否对药物敏感进行评价，继而进行有效化疗免去不必要的痛苦。该研究结果显示在低浓度药物处理1 h后，盐酸米托蒽醌能快速进入细胞内聚集成斑点状，且能有效的诱导细胞进入程序性凋亡。该研究为盐酸米托蒽醌运用于鼻咽癌治疗提供了体外的实验依据，但是由于体外和体内环境的差异以及鼻咽癌发生、发展过程的复杂性，该药物对鼻咽癌的治疗效果和作用机制还有待进一步的研究。

[参考文献]

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（收稿日期：2012-08-20）