油桐β-酮脂酰-CoA合成酶（KCS）基因的克隆与序列分析

周俊琴，谭晓风，刘美兰，龙洪旭

（1.经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）

油桐是大戟科Euphorbiaceae油桐属Vernicia植物，是我国特有而重要的经济林木，它与油茶、乌桕和核桃并称为我国四大木本油料植物[1]。油桐种子的含油率高达50%～70%，它具有优异的防水、防腐和绝缘等性能，是重要的工业油料[2-3]。

β-酮脂酯-CoA合酶（KCS）是植物体内超长链脂肪酸及其衍生物第2步合成中最重要的脂肪酰-CoA延长酶，它以油酯-CoA（或C20∶1脂酸-CoA）和丙二酰-CoA为原料，合成C20∶1或C22∶1的β-酮脂酰-CoA[4]。超长链脂肪酸是生物体中碳原子数超过18碳的脂肪酸，这一类脂肪酸在生物体中具有广泛而重要的生理功能，它们参与种子中甘油酯、生物膜膜脂和鞘脂的合成，同时为角质层蜡质的生物合成提供前体物质。角质层是植物自我防护的最后一道屏障，对植物生长发育和适应外界环境方面有着重要的作用[5]。目前，人们对脂肪酸延长酶基因的研究主要集中在β-酮脂酯-CoA合酶（KCS）基因的研究上。KCS基因家族主要存在于植物界中，且不同物种所具有的KCS基因家族成员的种类和数量都不完全相同。在拟南芥中，共有21个成员（KCS1～KCS21）[6]，其中，KCS1[7]、CER6（KCS6）[8-10]、FDH（KCS10）[11-12]和 FAE1[13-14]的功能已有报道。之后陆续分离得到西蒙德木KCS[15]、雷斯克勒KCS3[16]和苔藓类植物地衣FAE2[7]。在油菜中，主要对种子油脂中参与VLCFAs合成相关的FAE1（KCS18）基因做了大量研究[17]。β-酮脂酯-CoA合酶是超长链脂肪酸合成第1步缩合反应的限速酶，是在内质网中催化合成的。为给使用生物技术定向调控油料作物油脂组成奠定基础，对β-酮脂酯-CoA合酶基因进行了克隆与序列分析研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

2012年8月底在湖南省永顺县青坪镇中南林业科技大学油桐试验基地（国家油桐种质资源保存库）采集油桐种子，材料贮存于－80 ℃冰箱中。

1.1.2 试验试剂

试验所用试剂有：购自Invitrogen公司的PureLinkTM RNA Mini Kit；购自全式金公司的2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、大肠杆菌Trans-T1感受态细胞；购自Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶；购自天根公司的引物合成及测序；引物合成及测序结果由华大基因完成，其它试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成

采用试剂盒加CTAB裂解和氯仿/异戊醇抽提的综合方法提取油桐种子内的总RNA，之后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取效果。反转录反应按照TaKaRa 公司cDNA 合成试剂盒说明书完成得到1条链cDNA。

1.2.2 油桐KCS基因的克隆

从油桐种子转录组测序结果中获得KCS的全长序列，利用Primer Premier 5 软件设计的上游引物为：Vf_KCS-WF “GCAGAGCGTGAATCTCAA TAACT”；下游引物为：Vf_KCS-WR“CCAACT GATCTATCAAAGTACACTCCTC”。然后以油桐种子反转录的单链cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。反应体系及程序见Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶说明书。回收PCR产物并连接到pEASY-Blunt Simple平末端载体中，转化Trans-T1大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上筛选阳性，筛选的阳性克隆送华大基因公司测序。

1.2.3 生物信息学分析

通过生物信息学软件Vector NTI 10.3.0、GENDOC、MEGA5.10、UCSF Chimera对 油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因序列和测序结果进行分析和预测，并用在线软件Clustalw2、ProtParam、SignalP4.1、TargetP 1.1 Server、ProtScale、TMpred Server、Mobyle portal、SOPMA 和EsyPred 3 Dwebserver 1.0全面剖析KCS基因的结构与功能。

2 结果与分析

2.1 油桐种仁RNA的提取和KCS基因的克隆

对提取的油桐种仁RNA并电泳检测其完整性，结果如图1所示。由图1可知，RNA没有降解，且28S条带较亮。随后根据 TaKaRa 公司cDNA 合成试剂盒说明书完成反转录反应，从而得到第1条链cDNA，以此为模板进行PCR 扩增。

根据测序结果比对分析，Vf_KCS全长为 1 440 bp，见图2。其中 5′UTR 长为 41 bp，3′UTR 长为 61 bp，CDS长为 1 338 bp，推测其编码446个氨基酸。将Vf_KCS的CDS序列进行BLASTX 分析后共搜索到100多条相似度很高的KCS同源序列，其中与葡萄、草莓、陆地棉的相似度达81%，与油茶、浙江红山茶、黄瓜、鹰嘴豆的相似度为80%，与大豆、苜蓿、番茄的相似度为76%。因此可以判断Vf_KCS的CDS为β-酮脂酯-CoA合酶基因。

图1 油桐种仁RNA检测Fig.1 RNA detection of Vernicia fordii seed

图2 Vf_KCS的PCR扩增检测Fig.2 PCR ampli fi cation of Vf_KCS

2.2 油桐KCS蛋白结构分析

2.2.1 油桐KCS基因编码蛋白的氨基酸序列分析

油桐KCS基因全长1 338 bp，编码1个完整的开放阅读框（ORF）。该基因编码1个含446个氨基酸的核苷酸序列，是缩合酶超家族中的一员，由图3可以看出该基因编码的蛋白质具有3个酶活性位点、6个产物结合位点、5个丙二酰-CoA结合位点和多个二聚体形成位点，以及类查尔酮合酶（CHS-like）高度同源区域。通过得到的油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因的氨基酸序列信息以及其它物种的同种基因的序列信息，可知Vf_KCS的氨基酸序列有3个高度保守区，序列分别为“PTPSLSAM”、“FGNTSSSS”、“GSGFKCNSAVW”；1个β-酮脂酯-CoA合酶基因的催化区域，其中半胱氨酸cys为其催化位点，序列为“GMGCSA”，具体位置见图7。分析结果证实本研究克隆到了1条完整的油桐KCS基因序列。

2.2.2 油桐KCS基因编码蛋白的理化性质和疏水性/亲水性的分析

利用在线ProtParam对KCS基因编码的蛋白质进行了理化性质分析，结果表明：Vf_KCS所形成的蛋白相对分子质量为50.15 kDa；等电点为9.21；理论推导半衰期为30 h；编码蛋白的原子组成分别为C2264H3552N622O627S20；不稳定系数是33.88，由此说明这2个蛋白是稳定性蛋白。

图3 Vf_KCS蛋白保守结构域分析结果Fig.3 Analysis result of conserved domain of Vf_KCS protein

采用在线ProtScale分析预测Vf_KCS编码蛋白的疏水性，参照其数字文本格式分析发现Vf_KCS有265个亲水性氨基酸残基和173疏水性氨基酸残基，分别占总残基数的60.5 %和39.5 %，编码的氨基酸序列中亲水性氨基酸、疏水性都均匀分布在整条肽链中，脂肪系数为94.44，总平均亲水性为－0.035，综合分析可推测Vf_KCS基因编码的蛋白是亲水性蛋白。

2.2.3 油桐KCS基因编码蛋白的跨膜拓扑结构预测

根据在线Mobyle portal对Vf_KCS进行跨膜区拓扑结构预测结果如图4显示：Vf_KCS有2个跨膜域和3个疑似跨膜域，2个跨膜域的位置分别在整个序列的第17～37，300～320的氨基酸残基，3个疑似跨膜域位置分别在整个序列的第138～158，168～188，220～240的氨基酸残基。每个跨膜结构域由20个氨基酸残基组成的螺旋，同时该序列的跨膜蛋白N端位于细胞质中，C端位于细胞膜外。

图4 Vf_KCS 的跨膜拓扑结构预测Fig.4 Prediction of transmembrane topology in Vf_KCS

2.2.4 油桐KCS基因编码蛋白二级结构及三级结构的预测

在线工具SOPMA 软件预测分析Vf_KCS氨基酸序列的二级结构，结果显示Vf_KCS氨基酸残基组成为：α-螺旋（Hh）为 45.07%、β-折叠（Ee）为 15.25%、β-转 角（Tt）为5.61%、随机卷曲（Cc）为34.08%。并且可以推测α-螺旋最有可能的位置是3～35，60～ 70，106～ 120，185～ 195，245～255，283～ 300，307～ 322，349～ 359，364～372，383～393，415～423；β-折叠最有可能的位置是42～47，138～144，168～173，198～ 204，278～ 282，403～ 408，且 Vf_KCS的二级结构以α-螺旋和β-折叠为主。

根据EsyPred3Dwebserver1.0在线软件对Vf_KCS进行三维结构预测结果如图5，并利用本地软件UCSF Chimera 进行结构如图6分析显示：Vf_KCS编码蛋白由7个α螺旋和4个β折叠组成。从疏水表面立体图可以看到酶的整个轮廓，其中橘黄色为α螺旋，占主要部分。

图5 Vf_KCS带状立体模型Fig.5 Ribbons spatial model of Vf_KCS

图6 Vf_KCS疏水表面立体模型Fig.6 Hydrophobic surface graphic model of Vf_KCS

2.3 油桐KCS基因氨基酸序列同源性和系统进化树分析

将克隆得到的Vf_KCS的cDNA序列推导出的氨基酸序列与其它物种的KCS基因所编码的氨基酸通过在线软件clustalw2和GENDOC进行同源性分析，结果如图7所示；用软件MEGA4.0构建进化树（见图8）。结果显示此类蛋白质C端及中间区域保守性较高，如239～247，264～271，453～471，485～505等区段高度保守，N端保守性较差，N端物种之间的差异也比较大。同时，Vf_KCS与葡萄的KCS基因相似度最高达89.69 %，与其它植物的KCS基因所编码的氨基酸同源性大多在 80 %以上，但从不同物种KCS种系进化分析图来看，Vf_KCS与拟南芥的亲缘关系是最为接近。

3 结论与讨论

β-酮脂酯-CoA合酶是在内质网中催化超长链脂肪酸合成的第1步缩合反应限速酶，在植物脂肪酸合成途径中起着极其重要的作用，同时也是角质层蜡质生物合成的前体物质。本文从基因辨别、蛋白质的理化特性分析、结构预测、序列比对、分子进化等方面对油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因及其编码的蛋白质序列进行了分析，获得了一些该

序列的相关数据和信息，如Vf_KCS的CDS长度为1 338 bp，编码446个氨基酸，所形成的蛋白相对分子质量分别为50.15 kDa，等电点为9.21；它有3个高度保守区为“PTPSLSAM”、“FGNTSSSS”、“GSGFKCNSAVW”和1个β-酮脂酯-CoA合酶基因的催化区域为“GMGCSA”，其中半胱氨酸cys为其催化位点；Vf_KCS存在2个跨膜域和3个疑似跨膜域，二级结构以α-螺旋和β-折叠为主；与其它物种来源的β-酮脂酯-CoA合酶基因及其编码序列具有高度的同源性，并且在结构及特性上非常相符合，从而进一步验证了本试验所得的基因为油桐的β-酮脂酯-CoA合酶基因全长cDNA，为以后的油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因的研究工作提供了理论依据。下一步将通过各种试验验证该基因在油桐中的各种功能。

图7 不同物种KCS氨基酸序列比对结果Fig.7 Amino acid sequences alignment in KCS from different species

图8 不同物种KCS种系进化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of KCS from different species

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