Caspase-3与脑缺血再灌注后细胞凋亡相关性研究进展*

张 霞，高维娟

(1.承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000;2.河北化工医药职业技术学院)

综述讲座

Caspase-3与脑缺血再灌注后细胞凋亡相关性研究进展*

张 霞1，高维娟2△

(1.承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000;2.河北化工医药职业技术学院)

半胱氨酸蛋白酶-3;脑缺血再灌注;细胞凋亡

缺血性脑血管病是目前神经内科最常见的一种疾病，其致残率非常高。治疗一般是以疏通堵塞的血管、改善病变部位的血液供应为主，但当缺血部位的血液供应好转以后就容易发生更加严重的再灌注损伤[1]。脑缺血再灌注损伤是脑缺血后脑组织恢复血流灌注时引起脑细胞更严重损伤的一种病理生理现象。研究表明，脑组织缺血早期，缺血区以神经细胞坏死为主，而后期缺血半暗带发生的迟发性神经细胞死亡则以细胞凋亡为主[2]。细胞凋亡(apoptosis)是个不同于细胞坏死的新概念，并使人们对疾病的发生、发展和转归有了一个全新的认识。细胞凋亡是由体内外各种因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，是一个在基因调控下的严密、完整的程序化过程，以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段、细胞缩小、最终形成凋亡小体(apoptosis body)等形态变化为特征[3]。细胞凋亡的诱导及调控过程十分复杂，涉及一系列相关分子及信号转导通路，目前尚处于揭示阶段。现就Caspase-3介导的细胞凋亡途径在脑缺血再灌注损伤中的作用做一综述。

1 Caspase-3酶原及活酶的结构

Caspase家族是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，是目前已知的凋亡最后执行因子。凋亡的最后实施是通过Caspases的激活而实现的，而Caspase-3为该级联反应的下游关键因子，在各种启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用[4]。

Caspase-3又称为半胱氨酸蛋白酶32(cysteine protease P32,CPP32)，或称Yama、apopain等，是1994年被发现的一个促凋亡调节基因，相对分子质量为32kD[5]，在人类基因中定位于4q32-4q35.1处，其由3个区域构成:氨基端的原域(prodomain)、大亚单位和小亚单位。正常情况下，Caspase-3在细胞质中以无活性的酶原形式存在，其激活过程是一个产生p20/p10二聚体的蛋白水解事件。Caspase-3酶原在活化过程中从p28-Ser29和Asp175-Ser176二处被剪切，并形成P20和P12两个片段，两种亚基借P12再连接成具有活性的Caspase-3异二聚体。活化的Caspase-3的三维结构为两个异二聚体(大亚单位和小亚单位)以相对的方式形成一个四聚体，两个小亚单位在中间，大亚单位在外周。每个异二聚体包含一个活性位点，由大小亚单位的氮基酸残基共同组成，它们对结合和催化底物来说都是必需的[6]。两个亚单位组成的异二聚体，是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，是细胞凋亡的执行者，可以导致细胞结构的全面解体。

2 Caspase-3酶原的激活

Caspase-3酶原能被Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12及颗粒酶B等所激活。最近的研究表明，缺血-再灌流后细胞内大量自由基产生，导致细胞膜受损，同时线粒体及内质网等细胞器也损伤，进而能从不同的途径激活Caspase-3，导致细胞凋亡。目前认为，Caspases-3激活途径主要有三条[7]:线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路。脑缺血再灌注后，可以通过其中的一个或多个通路转导凋亡信号，进而激活Caspase-3，诱导细胞凋亡。

2.1 线粒体途径活化Caspase-3 细胞凋亡的线粒体通路:当细胞出现ATP耗竭，细胞内Ca2+超载，自由基增多，受体介导的死亡信号激活(Fas和TNF-R)及促凋亡和抗凋亡的Bc1-2家族蛋白的表达发生变化时，均可引起线粒体膜孔开放，导致线粒体通透性改变。线粒体通透性改变的结果是线粒体肿胀，内膜极化，氧化磷酸化脱耦连，以及内膜蛋白(细胞色素-c，凋亡诱导因子AIF)释放。AIF可活化效应性凋亡蛋白酶，进而激活线粒体释放细胞色素-c(Cyt-C)大量进入胞浆，在dATP/ATP存在的条件下，与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)结合，形成cyt-c-Apaf-1复合物，此复合体通过Apaf-1氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白相互作用，以1:1比例募集胞质中的Caspase-9，Caspase-9酶原之间因相互靠近，自我剪切而活化[8]。活化的Caspase-9进而激活Caspase-3，导致细胞凋亡。

2.2 细胞膜途径激活Caspase-3 细胞凋亡的死亡受体通路:死亡受体属于肿瘤坏死因子受体基因超家族成员，可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号。目前的研究发现，至少有5种死亡受体在细胞凋亡信号传导中起作用，最典型的是Fas。一旦细胞受到某些凋亡信号的刺激， Fas分子可与其特异性配体Fas-L结合。Fas-L以同源三聚体复合物形式存在, 每一个Fas-L三聚体可结合三个Fas分子，导致三个Fas分子内的DD(Death domain)相互串联。串联的Fas的DD可以与FADD(Fasassociated death domain)的DD结合，这种结合又导致FADD的DED(Death effectdomain)与Caspase-8酶原的DED类似区域结合，从而激活Caspase-8，Caspase-8进一步激活下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡[9]。

2.3 内质网应激诱导Caspase-3表达 细胞缺血缺氧、葡萄糖/营养物质缺乏、ATP耗竭、大量自由基的产生、钙超载、蛋白降解减弱等均可引起内质网(endoplasmic reticulum，ER)功能障碍，从而触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。过度ERS通过PERK(PERK为I型内质网跨膜蛋白，属于elf2a蛋白激酶家族成员)活化、elf2a磷酸化等途径诱导Caspase-12、CHOP(C/EBP homology protein是 一个b-zip转录因子，属于CCAATP增强子相连蛋白的转录因子C/EBP家族，又称作GADDl53)等活化，促进细胞凋亡。CHOP通过下调Bcl-2表达，耗竭谷胱甘肽，促进反应性氧族产生等，进而活化Caspase-3，导致细胞凋亡[10]。活性Caspase-12需则与另外内质网应激分子协同使Caspase-9激活，活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效应Caspase，效应Caspase切割多ADP-聚合酶(PARP)和多种其它细胞内的底物，最终导致细胞凋亡，属于非Cyt-c依赖的特异级联反应[11]。

3 Caspase-3与脑缺血再灌注后细胞凋亡

3.1 Caspase-3可促进脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡脑缺血/再灌注损伤是一种常见的、复杂的病理生理过程[12]。Tominaga等[13]首次证实缺血性脑损伤可引起神经细胞凋亡。近年来，许多学者也从形态学、分子生物学等方面研究证实，细胞凋亡参与了脑缺血再灌注损伤。有研究表明[14]，脑缺血后随着再灌注时间的延长，缺血侧皮层凋亡细胞数量明显增加，主要分布在梗死灶边缘区，48h凋亡细胞达到高峰，说明凋亡在脑缺血/再灌注损伤中起重要作用。Caspase-3也参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，并在脑缺血再灌注损伤中起重要的作用[15]。近来还认为Caspase-3的激活是参与脑缺血后神经元凋亡的关键步骤, Caspase-3是最终执行者[16],在脑缺血损伤中起重要作用。动物实验[17]显示,在成年正常大鼠脑组织中,Caspase-3表达水平较低。脑缺血后,缺血半暗带区的Caspase-3表达明显增加，并在24h达到高峰[18]。赵敏等研究证实[19]，大鼠局灶性脑缺血及再灌注早期，Caspase-3表达变化不明显，再灌注6h-48h逐渐增高，在48h达到高峰，与神经元凋亡DNA裂解率表达时间分布一致，几乎是在相同的时间，同样提示Caspase-3参与了缺血后细胞凋亡过程。应用Caspase-3抑制剂可使缺血神经元的损伤明显减轻，也支持脑细胞缺血死亡涉及Caspase-3的观点[20]。Le研究也表明，和正常大鼠相比，Caspase-3基因敲除的大鼠脑缺血2h再灌注48h后，皮层的梗死体积降低了55%，TUNEL阳性细胞密度下降了36%，说明Caspase-3在脑缺血再灌注细胞损伤中发挥了重要作用[21]。另有文献报道，在缺血缺氧性脑损伤及脑缺血再灌注损伤中，应用Caspase-3抑制剂可有效地减少脑缺血后神经元凋亡的数量，从而起到脑保护作用[22]。以上的研究结果说明，Caspase-3参与了缺血性脑损伤，并在缺血神经元的凋亡过程中发挥重要作用。

3.2 Caspase-3在脑缺血再灌注后细胞凋亡中的作用机制 Namura[23]在小鼠MCAO模型中观察到再灌流后不仅Caspase-3mRNA表达增加，而且Caspase-3裂解物免疫反应也增强。活化后的Caspase-3可以切割许多蛋白质底物, 所作用的底物多为维持细胞生命活动的重要功能蛋白，它们分别参与细胞骨架重建、DNA修复和mRNA裂解。多种多样的刺激因素均可以激活Caspase-3，引起多效基因变化，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活[24,25],从而导致细胞不可逆性地走向凋亡。

目前所发现的Caspases的底物一共有40种，其中大都可为Caspase-3所降解。Caspase-3可以水解结构蛋白(A-spectrin、B-spectrin、tau蛋白等)、看家蛋白(actin、fodrin、keratin)等，使细胞骨架结构破坏，核蛋白瓦解，染色体浓缩。Caspase-3也可以水解脱氧核糖核酸酶(CAD)的抑制蛋白ICAD，使CAD 活化进入细胞核发挥核酸酶功能，使 DNA断裂进而降解染色体，直接导致细胞凋亡。Caspase-3还可以裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，发挥促进凋亡的作用。同时，Cheng等[26]研究证实，当Bcl-2蛋白被Caspase-3直接剪切，剪切后形成的片段可以进一步促进下游Caspase-3激活和放大Caspases级联反应，这样就形成了一个Caspases级联反应的正反馈环路，证明了其裂解产物也可以促进凋亡。Caspase-3 还能水解并灭活DNAPKcs、PARPD 等DNA 修复酶，阻断DNA的复制与修复，干扰剪切，破坏DNA结 构。Caspase-3还 能 识 别PARP(poly ADP-ribose polymerase)中 的Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列，从而切割PARP，被切割的PARP激活受PARP负调控的核酸内切酶的活性，最终使核小体间的DNA 降解，出现形态学上的DNA梯带。Nicholson等[27]报道，活性Caspase-3能够在哺乳动物细胞中剪切多聚ADP-核糖多聚酶导致细胞凋亡。Endres等[28]同样证实了活性Caspase-3的这一重要效应。有研究报道,Caspase-3还能诱导细胞表达吞噬信号，使细胞水解为凋亡小体被吞噬细胞吞噬消除，产生凋亡的不可逆效应。

4 结语

脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生是一个复杂的过程，诸多研究显示其发生是多因素协同作用的结果，可通过各种途径激活Caspase-3，使细胞发生凋亡。了解Caspase-3在不同条件下的表达情况，可选择合适的时间窗有针对性地选用Caspase-3抑制剂，尽量减少脑缺血再灌注后神经元的凋亡，对于阻止脑神经功能的进一步恶化、改善脑神经功能具有重要意义。

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Q255

A

1004-6879(2013)01-0055-04

2012-10-11)

*国家自然科学基金项目(81072923)

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