标记基因对土壤微生物潜在影响的研究进展

洪求枝 （长江大学工程技术学院，湖北 荆州434020）

标记基因可为获得真正的转化体提供判断依据，在植物遗传转化中发挥着至关重要的作用。自1983年第一株转基因植物诞生以来，所有正在进行的田间试验和被批准进行商业化应用的转基因植物几乎都含有标记基因。然而，标记基因在为转基因植物筛选带来便利的同时，有人担心其表达产物可能对生态环境和人类健康产生一定的影响。为此，笔者就转基因植物中常用的标记基因及其对土壤微生物潜在影响的研究进展进行了综述。

1 标记基因的研究

选择标记基因 （selectable marker gene）简称标记基因 （marker gene），是一些已知效应的基因，它能够使个体具备特定的特征并且通过生理学、形态学、生物化学或分子生物学手段检测其存在且效果明显的基因，这些标记基因在转化过程中起到重要作用。目前绝大部分植物的转基因需要融合标记基因，以便于检测。转基因研究中普遍应用的抗性标记基因在植物转化过程中是很有利的选择工具，可大大减少区分转化和非转化细胞的工作量。

1．1 常用的标记基因及作用

根据标记基因的功能，可将其分为选择基因和报告基因2类［1］。选择基因的编码产物可使细胞或组织具有除草剂或抗生素的抗性，或者具有代谢优越性。当环境中存在抗生素或除草剂等选择试剂时，转化的细胞或植株能够存活从而被筛选出来。报告基因是指其编码产物能够被快速测定、且不依赖于外界压力的一类基因。目前常用的报告基因大多是一些酶基因，如氯霉素乙酰转移酶基因 （cat）、荧光素酶基因 （luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因 （gus）等。

植物转基因研究中使用较多的是选择基因，选择基因可以分为2类：即抗生素类选择基因和抗除草剂类选择基因［2］。

抗生素类选择基因，如对卡那霉素、G28、巴龙霉素和新霉素有抗性的新霉素磷酸转移酶基因（npt），氯霉素抗性的氯霉素乙转移酶基因 （cat），链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶基因 （Spt），潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因 （aphV）及庆大霉素和博来霉素抗性基因等。其中卡那霉素抗性基因是在植物基因转化上最早也最常用的显性选择标记，潮霉素抗性基因也是目前较常用的标记基因［1］。

卡那霉素抗性基因的标记原理是以nptII基因作为遗传标记基因，该基因编码的新霉素磷酸转移酶II能使植物产生抗卡那霉素特性［3］，故可用卡那霉素对转化的植株进行筛选，已报道的方法主要用在田间对棉花叶片涂抹卡那霉素进行检测［4-8］。

潮霉素对应的标记基因主要为潮霉素磷酸转移酶基因 （aphⅣ），利用农杆菌转导法将重组基因转入植物细胞［9］。潮霉素抗性基因还可以分为aph（4）-Ia（或hph）基因及aph（4）-Ib（或hyg）基因，又称hpt。实验证明hpt基因是单子叶植物较为理想的筛选基因，其优点有：选择效率高、基因型差异小、对转化细胞不产生或很少产生毒害作用、再生的转基因植株育性较好等［10］。目前，hpt基因在水稻、玉米和小麦等作物上有着广泛应用，大多数转基因水稻的有关研究都以其为选择标记。

1．2 标记基因的潜在风险

标记基因在为转化植株的筛选提供了方便，但选择标记基因在完成筛选、得到所需要的转化植株之后失去了利用价值，甚至有潜在危害，其危害性主要包括食品和环境2方面：（1）食品安全性方面。标记基因可能被转入人与动物的肠道微生物和上皮细胞，从而降低抗生素在临床治疗中的效用。标记基因的表达产物也可能对人与动物的肌体产生一定影响［11］。（2）环境安全方面。标记基因涉及到的环境安全问题则主要有：编码抗生素或除草剂的标记基因可能发生漂移，进入野生亲缘种中，产生具有抗性的“超级杂草”。转入标记基因的植物可能对环境中其他动植物产生选择，从而改变生态组成，破坏生态平衡［12］。标记基因表达产物可能对环境中动植物和微生物产生选择，从而改变生态组成。标记基因可能转移到微生物中，导致土壤中超级细菌的产生，对土壤生态系统造成破坏。

1．3 解决标记基因安全性问题途径

可以通过回避或剔除标记基因以及发展安全标记基因等方法来解决标记基因的安全性问题。之所以要剔除标记基因，一方面是因为转基因植物一旦再生成功，标记基因便不再有用；另一方面，基因转化系统中一些辅助序列 （包括标记基因）的消除可以减少同源区序列造成的遗传不稳定［13-15］。目前，比较有效的标记基因剔除系统主要有：双T-DNA载体共转化系统、转座子系统、位点专一性重组系统和染色体内同源重组系统［16］。

安全标记基因多来自于植物本身，不会破坏生态平衡。国内有报道［17］磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因、绿色荧光蛋白基因等6种基因可代替传统的抗性标记基因，实现植物转化无害化。

2 标记基因作物对土壤微生态的影响

土壤微生态系统包括土壤微生物种类与数量、土壤理化性质、土壤养分的释放及有效性等，是地球生态系统物质与能量循环的重要场所与组成部分。有研究表明，改变土壤微生物群落将影响土壤微生物呼吸速率及其温度敏感性，从而间接影响全球气候变化趋势［18-19］。也有研究证实标记基因作物中转Bt基因棉花和马铃薯的根系分泌物对其根际微生物在数量方面与对照间差异不显著［20-22］。

2．1 标记基因产物进入土壤的途径

标记基因产物进入土壤的途径是多种多样的，其中最直接的途径包括植株残茬分解、根系分泌以及花粉落入。这些进入土壤生态系统的标记基因表达产物都可能对土壤生态系统产生影响［23］，进而对整个生态系统产生影响。

2．2 标记基因表达产物对土壤微生物群落的影响

土壤微生物是重要的分解者，将土壤中有机养分转化为无机养分，以利于植物的吸收利用。合理利用土壤微生物可以提高农作物产量、保护濒危植物、恢复退化植被和修复被污染的土壤［24］。导入作物中的外源基因及其所表达的蛋白可通过作物残体、根系脱落物和分泌物等进入土壤，对土壤环境的生态平衡产生长远的影响，进而影响土壤微生物、昆虫、软体动物的分布等［25］。而植物基因转化中的选择标记基因亦属于外源基因，理论上也极有可能对土壤微生物造成影响，而且由于大多数转基因育种仍然依赖于选择标记基因，故研究标记基因对土壤微生物的影响尤为重要，目前很少有报道研究这方面内容，以前的研究依然集中在以转基因玉米、棉花、水稻、大豆、油菜等植物个体为实验对象的水平上。因此，标记基因对土壤微生物的影响有待进一步地研究。

2．3 标记基因表达产物对土壤微生物种类和数量的影响

标记基因会同目标基因一起整合到植物基因组中，通过重组、转导、转化等途径在微生物之间相互转移。另外，标记基因跟其他基因一样，进入植物基因组后，会破坏基因组的完整性，所以转标记基因的植株一般也会变小、花期延长、育性一般也会降低。在地下部分，转标记基因的作物在根尖有时会有分泌物，这些分泌物可能会对土壤中的微生物造成影响，尤其是其种类和数量Donegan等［26］就转蛋白酶抑制剂基因烟草对土壤微生物种类和数量的潜在影响进行了研究，结果发现转基因植物根际土壤中存在更多的线虫，而Collembola的数量则显著降低。

3 结语

筛选标记在植物遗传转化中极为重要，但在完成筛选的使命后也可能给环境带来不利的影响。通过研究标记基因对土壤微生物的影响来考察其土壤环境安全性将有助于更好地了解标记基因，更安全地应用标记基因，并为其应用和使用后环境安全问题的解决提供参考，为转基因作物的大规模推广应用的安全评估提供基础。

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