胚胎干细胞的应用研究

甄 珍，郭 英，边育红，张艳军（天津中医药大学，天津300193）

·现代医学·

胚胎干细胞的应用研究

甄 珍，郭 英，边育红，张艳军*（天津中医药大学，天津300193）

胚胎干细胞（ES）是来源于早期胚胎内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PGC）的一种多能细胞，具有体外无限复制和高度分化潜能的特性。目前，胚胎干细胞已逐渐应用在胚胎干细胞体外测试（EST）与新药开发，移植治疗与细胞替代治疗，转基因动物与克隆上，并已取得了一定的研究成果。

胚胎干细胞；生物学特性；EST；新药开发；移植治疗；细胞替代

胚胎干细胞（ES）是来源于早期胚胎内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PGC）的一种多能细胞。具有无限自我增殖的能力，即体外培养时ES细胞可以在一定的条件下保持不分化状态且无限的自我复制。ES细胞还是一种全能干细胞，在特定条件下可向3个胚层的组织和细胞分化［1］。通常改变抑制ES细胞不分化状态的培养条件，ES细胞就可以分化成多种细胞类型。ES细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性，使其广泛应用于生物学研究的各个领域，它的潜在医学应用价值已成为世界范围内研究的热点。特别是在建立EST（胚胎干细胞体外测试）、新药开发、细胞组织器官的移植治疗和替代治疗、转基因动物与克隆上有着广阔的应用前景。

1 EST与新药开发

1.1 EST 根据ES细胞的特性，有研究者［2］提出了EST预测模型，经过许多研究的验证发现ECVAM（欧洲替代方法验证中心）项目中提出的体外毒性试验是合理的。关于EST作为体外筛选和评价受试物的方法也为ECVAM所接受［3］。

EST不仅可以研究药物的细胞毒性，还可以研究胚胎发育毒性。EST与体内测试相比，无需考虑药物在动物体内的代谢：与其他体外测试相比，不需大量的动物，其无限传代的特性可以保证源源不断的细胞供应；与细胞毒性测试相比，ES细胞比成体组织对药物毒性的敏感性要高，并且更容易检测受试物和代谢产物的浓度［4］。

EST具体研究过程见参考文献［2］。于洲等［5］在已经建立的ES细胞经体外诱导向心肌细胞分化的基础上利用前期RA（视黄酸）体外诱导ES细胞向神经细胞分化，建立ES细胞向神经发育毒性评价的模型，通过评价了5－FU、DPH、青霉素的神经发育毒性，初步验证了该方法的有效性，从而对EST评价体系进行了丰富和完善。

1.2 新药开发 在药物研发过程中体外实验虽然不能完全取代体内实验，但细胞实验可以作为其他实验的先导，为以后的体内实验提供行之有效的药理药代等数据，减少实验所需动物，减低成本。目前药物开发过程中所用的细胞大都来源于动物细胞或癌细胞，这些细胞不能完全反应人体对药物作用的效果。ES细胞可以诱导分化成任何组织类型的细胞，在药物开发过程中可以提供大量用于实验的细胞。EC（欧共体）建立了一项有针对性的研究项目“InVitroHeart”，旨在开发人ES细胞源心肌细胞的体外毒性试验。将人心肌细胞培养与电生理和细胞毒性微传感器平台结合标准化，已达到快速筛选药物的目的［6］。另外，ES细胞在胚胎毒性测试和肝毒性测试中也取得了很大进展［7］。

ES细胞还可用于创建动物模型，通过改变动物基因，建立与人类相似疾病的动物模型，应用于药物筛选的过程中，可以准确、快速的筛选出合适的药物，目前这种方法已成为药物筛选的手段之一［8］。近年来，兴起的基因打靶技术是基于同源重组和ES细胞之上的一种可以定向改变生物体遗传信息的实验手段，同源重组是两段含有相似核苷酸的DNA序列中自发交换遗传信息的过程［9］。基因打靶技术将含有已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术［10］。ES细胞常用做基因打靶的靶细胞，利用基因打靶技术将外源DNA与ES细胞中的相似部分重组或靶向破坏等位基因，创建人类疾病的动物模型［11］。若将修饰过的ES细胞注入小鼠囊胚中，形成嵌合小鼠。从而在某些特定基因的研究过程中提供丰富的小鼠模型［12］，有研究人员［9］建立了500多个关于癌症、糖尿病、心血管疾病、神经疾病等人类疾病的小鼠模型，用于制药企业的药物发现和筛选。

2 移植治疗和细胞替代治疗

ES细胞在特定条件下可向3个胚层的组织和细胞分化。3个胚层包括外胚层、中胚层、内胚层。外胚层可以分化产生外周、中枢神经系统、上皮系统的细胞等。中胚层可以分化为肌肉、骨、软骨、造血和结缔组织及上皮组织等。内胚层可以分化成胰细胞、肝细胞等［13］。由疾病或外伤导致的细胞损伤都可以通过将ES细胞定向分化成的特异性组织细胞或器官来治疗。由于心肌损伤导致的心脏病会使具有完整收缩功能的心肌细胞的数量减少，因此治疗的关键是要增加具有完整收缩功能的心肌细胞数量。Min JY等［14］将经过绿色荧光蛋白（GFP）转染培养的ES细胞注入由于左冠状动脉前降支结扎造成的心肌梗死（MI）引起的损伤心肌上，ES细胞移植6周后，MI动物心脏功能获得显著改善，且MI区域的心肌切片呈GFP阳性且有典型的条纹、心肌肌节α－肌动蛋白、心脏α－肌球蛋白重链和肌钙蛋白Ⅰ的强阳性证实移植的细胞存活和向心肌细胞的分化。这些数据表明，ES细胞移植是可行的，有望成为治疗心肌梗死等心肌损伤性疾病的新方法。

目前临床上对于烧伤或创伤的患者主要是通过自身皮肤移植来治疗，但是严重的烧伤或创伤的患者根本无法进行移植治疗，ES细胞可诱导分化成表皮干细胞用于治疗烧伤或创伤。刘爱军等［15］将ES细胞源性的表皮干细胞移植到小鼠全层皮肤创伤面上，发现不仅能修复缺损表皮，而且有分化为汗腺样、毛囊样结构的潜能。

ES细胞还可以用来治疗丧失正常细胞功能的疾病如退行性病变、遗传性疾病和肿瘤等。帕金森病（PD）是由于脑中多巴胺神经元丢失而导致的慢性中枢神经系统退行性疾病。迄今，无论是药物还是手术治疗都无法根治。而利用细胞替代治疗，将ES细胞经体外诱导分化成产生多巴胺能神经细胞，再将这些细胞注入病变区域，就有可能治疗帕金森病。体外诱导ES细胞向多巴胺能神经元分化的方法可以采用经典五步法，此方法通过模仿体内ES细胞的生长分化环境，逐步改变ES细胞的培养液成分，添加不同的生长因子和神经营养因子等，诱导ES细胞向多巴胺能神经元分化。这种方法简单，对细胞毒性小，且分化成的多巴胺能神经元较纯。刘平等［16］利用无血清培养基的筛选和培养，在SHH和FGF8等细胞因子的共同作用下使其定向分化成为络氨酸氢化酶阳性的神经元。此外，与基质细胞共培养、基因修饰等方法也可产生纯度较高的多巴胺能神经元。

许多Ⅰ型糖尿病患者体内，生成胰岛素的β细胞及其他功能性细胞都被破坏。Lumelsky等［17］将ES细胞诱导分化成为能分泌胰岛素和其他胰腺内分泌激素的正常的胰岛细胞，注入糖尿病鼠后形成了胰岛样结构。如果将这些ES细胞分化成的胰岛样细胞移植入患者体内，就可能使糖尿病从根本上得到治疗。

3 生产转基因动物与克隆

3.1 生产转基因动物 转基因动物是基因组中含有外源基因的动物。通过细胞融合、细胞重组等技术将外源基因导入精子、卵子或受精卵中，通过生殖，在后代中形成可能会有携带目的基因的转基因动物。传统的转基因动物生产方法是将目的基因注射到受精卵中，目前人们已成功的获得了转基因鼠、鸡、猪、牛等动物。但此方法只能在个体水平上进行，且工作困难、效率低、周期长。随着科学技术的不断提高，目前可以在细胞水平上筛选出最佳的细胞系，通过定向改变ES细胞，使其携带理想的目的基因，再将转基因的ES细胞注入到受精卵中或将转基因的ES细胞与胚胎共培养，使ES细胞与正常胚胎形成嵌合体，在下一代中将出现计划中的转基因动物。这种方法无需大量的动物且周期短，极大地提高了动物的生殖效率。Wood SA等［18］将小鼠胚胎与ES细胞共同培养，形成嵌合胚，这种方法生产的小鼠ES细胞嵌合率很高，大大降低了实验者的时间和精力。转基因动物还可以用来生产基因工程药物，将某些有预防或治疗作用的药用蛋白质的基因提取出来，导入到转基因动物中，就可以从转基因动物的乳汁和血液中提取大量的这种药用蛋白质，来满足临床和试验的需求。

3.2 克隆 体细胞核移植即克隆，是近年来出现的一种新的转基因技术。体细胞核移植是将外源基因与供体细胞共培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞（去核卵母细胞）上，构成重建胚，在将其移植到假孕母体上分娩，得到转基因动物。1996年英国制造了第一只体细胞核移植的克隆的动物绵羊多利。目前已经成功克隆出牛、羊、狗等多种动物。有实验者［19］利用核移植将牛的ES细胞核移植到去核卵母细胞中，形成重建胚，再移植入牛的受体子宫内，后经过超声检查，发现有胎儿存活。利用ES细胞进行核移植可以快速繁育优良物种，加快动物的育种工作，在保护珍稀物种方面有重大意义。

4 现存问题

4.1 控制ES细胞定向分化 细胞分化是一个复杂的生理生化反应过程，且ES细胞容易自主分化，对培养条件要求较高，对多种细胞因子、培养液环境等的影响敏感。要诱导ES细胞向预期方向分化，必须深入研究分化过程中所需的最佳环境。

4.2 移植带来的免疫排斥反应 ES细胞移植时会因供体和受体的ABO血型抗原、主要组织相容性抗原、次要组织相容性复合物抗原的不同而诱发免疫排斥反应［20］。

4.3 ES细胞成瘤性 ES细胞可以无限增殖，如何控制其分化数量，使其达到足够的治疗数目且不会无限增殖而引起畸胎瘤仍需深入研究。

4.4 转基因动物存活率 目前克隆的成功率较低，且克隆成功的动物多数表现出严重的生理或免疫机能缺陷等问题，最终导致死亡。因此，克隆技术仍需进一步的研究深入。

除去现有技术和研究的不足外，影响ES细胞应用的最大问题即伦理问题，其关键问题是如何判定人格和生命。儒家学者认为人是有精神心理活动的有形体，胎儿不具备这些活动，所以不能称之为人。也有很多社会伦理学家认为胚胎即意味着新的生命开始，其权利需要得到保护。但更多科学界人士更倾向于14d内的胚胎不是人格的生命，不具备神经系统和大脑，不会感觉到疼痛，故而不应给予胚胎完全人权，可以用于生命科学的研究［21］。

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R331.2

B

1007－4813（2013）02－0319－03

2012－10－28）

中国博士后科学基金资助项目（200902281）；国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目（2011CB505302）。

甄 珍（1987－），女，硕士研究生。研究方向：中药药理学。

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张艳军，男，博士，教授，博士研究生导师，E－mail：zyjsunye＠163．com。