离心运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡和增殖的影响*

宋卫红，汤长发，刘文锋

（1．湖南人文科技学院体育科学系，娄底417000；2．湖南师范大学体育学院，长沙410012）

细胞凋亡是细胞接受某种信号或受到某种因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。它既出现在个体正常的发育过程中，也出现在非正常生理状态或疾病中。研究人员应用电子显微镜、TUNEL、凝胶电泳DNA片断检测、流式细胞技术等方法，发现运动性心肌微损伤，运动性肝损伤、肾损伤，脑损伤，神经组织损伤，内分泌腺损伤等发生过程中都有细胞凋亡的参与，而且细胞凋亡程度与运动强度、运动量有关。细胞凋亡（apoptosis）在运动期间和之后的骨骼肌细胞损伤中也扮演着非常重要的作用。有研究证明骨骼肌细胞凋亡具有一定的时相性，蔡保塔等在研究不同运动强度与骨骼肌细胞凋亡的关系时发现在运动训练前3天，腓肠肌细胞凋亡明显升高，与骨骼肌运动损伤主要临床症状表现出延迟性肌肉酸痛发生时相相一致［1］。黄颖峰［2］等人在研究恒定负荷耐力训练对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响时发现第1，2周周末运动后24 h时恢复组骨骼肌细胞凋亡率均大于运动后即刻组和运动后3 h组，提示运动导致的肌肉细胞凋亡有一定时相性和矛盾性，运动导致的细胞凋亡不是运动后即刻发生的，而是延迟性的。但 Podhorska-Okolow等［3］对运动后正常鼠的细胞凋亡情况进行时相研究时发现，鼠自发的在鼠轮中跑一昼12 h后诱发骨骼肌损伤，发现运动后即刻细胞凋亡比例较高，6 h后凋亡下降，而96 h后凋亡不足1%。离心运动是致骨骼肌微损伤的主要运动方式，离心运动对细胞凋亡的时序性影响如何，它是否与运动骨骼肌微损伤有一定的关联，还需要更多的实验来证明。

肌卫星细胞是位于基膜与细胞膜之间的一群单核细胞，当肌肉损伤、坏死或负荷过重时，该细胞被激活，开始增殖、分化并融合成肌管，或迁移到受损的肌管处，最后形成新的肌纤维或修复受损的骨骼肌纤维。在超负荷或肌肉损伤后，肌卫星细胞增殖形成新的肌核来保证骨骼肌细胞的生长和修复。细胞的发生、增殖、分化和死亡的过程是密不可分的。凋亡和增殖的相互平衡才能使细胞和组织保持稳定。离心运动后不同恢复期的细胞凋亡和增殖在运动性骨骼肌微损伤和修复中扮演着重要角色。本实验利用电子显微镜结合TUNNEL和PCNA免疫组织化学方法探讨凋亡和增殖在运动性骨骼肌微损伤和修复中的作用。

1 材料与方法

1．1 实验对象及分组

健康成年 8周龄雄性（SD）大鼠 50只，体重（212．55±15．74）g（购自湖南农业大学动物中心，许可证号：湘scxk 2009-003），为清洁级实验动物。以国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养，自由饮食和饮水。适应喂养三天后，进行一次5～10 min跑台运动适应性训练（速度为16 m／min，坡度为0°）。随机分成对照组（C）和运动后即刻（B1）、运动后 3 h（B2）、运动后 24 h（B3）和运动后 48 h组（B4）（n＝10）。实验期间室温为 20℃～25℃，相对湿度为45%～55%，自然昼夜节律变化光照。

1．2 运动方案

运动组大鼠进行3 d的运动跑台适应性训练（速度为 16 m／min，坡度为-16°，时间为 5～10 min）后，休息两天，正式开始实验。进行重复三天力竭性离心运动，力竭模型采用跑台运动，速度为16 m／min，坡度为-16°，持续运动至力竭。运动中采用电刺激或毛刷机械刺激鼠尾部，当动物出现卧位跑、反应迟钝，“逃避反应”极差，短时间休息后（低于10 min）仍无法持续运动，则视为力竭。

1．3 标本制备

实验运动方案结束后，在每组10只动物中随机取2只右前肢肱三头肌内侧头下端0．5 mm×0．5 mm×0．2 mm标本放入2．5%戊二醛中固定，以备透射电镜制备。迅速取右前肢肱三头肌内侧头下端肌腱和肌腹交界处取约1．0 mm×1．0 mm×0．2 mm标本放入4℃预冷的生理盐水洗净血液，滤纸吸干肌肉组织表面水分，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，4℃冰箱保存，进行常规石蜡包埋。

1．4 指标测试

1．4．1 骨骼肌细胞凋亡测定 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）检测凋亡细胞。严格按细胞凋亡检测试剂盒（美国Promega公司）操作。在普通光学显微镜下观察，阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染。根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞：（1）具有凋亡的核形态；（2）周围或局部无炎症反应。光学显微镜（×400）下每张切片随机观察6个视野，每个视野至少100个细胞核水平。以Simple PCI显微图像分析软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（Apoptosis Index，AI）。

1．4．2 PCNA的免疫组织化学测定 采用常规两步免疫组化法，按试剂盒（美国Signet公司）说明书操作。以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：成肌细胞的细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen；PCDA）阳性染色模式为胞核着色，呈浅黄色至棕黄色颗粒。染色判断标准：阴性不着色，弱阳性呈淡黄色，阳性呈黄色，强阳性呈棕黄色或棕色。阳（阴）性细胞计数方法：光镜下，每张切片按对角线划分区域选取5个视野，每个视野观察100个细胞，统计出阳性细胞数，最后计算100个细胞中阳性细胞数，即增殖指数（Proliferation Index，PI）。

1．5 统计学处理

所有数据以均数±标准差（±s）表示。统计分析使用SPSS 11．5统计分析软件完成。各组之间，C、B1、B2、B3、B4采用单因素方差（one-way ANOVA）分析。

2 结果

2．1 大鼠骨骼肌细胞凋亡变化

2．1．1 计算机显微图像观察 使用TUNEL法对骨骼肌细胞凋亡进行检测，光镜下观察凋亡细胞核呈棕黄褐色为阳性细胞核，正常的细胞核呈蓝色。对照组，可偶尔见到阳性的细胞核；运动后即刻组，可见到较多的棕黄色阳性凋亡核，凋亡核并不平均分布在每个肌细胞中，而是以肌束为区域分布。但是运动后3 h凋亡核却减少了，运动后24 h组凋亡核最多，运动后48 h组凋亡核的数目有所减少。

2．1．2 显微图像分析结果 利用麦克奥迪图像分析系统对凋亡率进行统计，发现运动后即刻细胞凋亡指数明显高于对照组 （P＜0．01）；运动后3 h凋亡指数下降，与运动后即刻没有显著性差异（P＞0．05）；到运动后 24 h，凋亡指数升高，明显高于运动后即刻和运动后3 h（P＜0．05）；运动后48 h凋亡指数比运动后24 h有所下降，但还是明显高于对照组（P＜0．05，表 1）。

Tab．1 Apoptosis occurrence and index（AI）of skeletal muscle cell in different restoration stages（%，¯x±s，n＝10）

2．1．3 透射电子显微镜观察结果

在电镜下观察肌纤维的超微结构，重点观察细胞核及线粒体的变化，正常肌细胞核为长椭圆形，含有弥散的染色质，其位置紧靠质膜下，根据电镜观察到质膜下细胞核出现独特的凋亡特征，就可以确定为肌细胞核凋亡。凋亡肌细胞核呈现不规则的形状，高度凝缩的染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构，或沿核膜内表面分布，凋亡细胞核所在的肌纤维膜完整，凋亡核附近未见明显的肌原纤维损伤，但线粒体增殖，部分线粒体出现肿胀或空泡（图 1）。

2．2 大鼠骨骼肌卫星细胞增殖结果及分析

2．2．1 计算机显微图像观察 光镜下检测PCNA蛋白表达阳性信号定位于细胞核，核着黄色或棕黄色。在运动后即刻组和运动后3 h组染色较深，呈棕黄色，但在运动后24 h和48 h染色较浅，呈淡黄色或淡棕色。以肌束为区域分布，有些肌束增殖较多，而另一些肌束内增殖很少或没有。

Fig．1 Electron micrographs of cell in skeletal muscle of rats C：Morphology and nuclei of normal skeletal muscle fiber was regular（×18．2K）；B1：Apoptotic cells nuclei appeared（×18．6K）；B2：Chromatic agglutination as crescentiformappeared（×36．4K）；B3：More apoptotic cells nuclei was observed（×30．3K）；B4：Nuclear cracks was observed（×36．4K）

2．2．2 显微图像系统分析结果 对照组出现少量的黄色增殖核。增殖指数仅为11．860%±2．996%。运动后肌卫星细胞增殖指数明显高于对照组，运动后即刻，增殖指数为40．840%±7．961%，与对照组具有显著性差异（P＜0．05）；运动后 3 h，肌卫星细胞的增殖指数下降，与运动后即刻组差异显著（P＜0．05）；运动后 24 h达到最高值，增殖指数为46．127%±8．899%，与对照组具有显著性差异（P＜0．05），与运动后 3 h也有显著差异（P＜0．05），但是与运动后即刻没有显著性差异（P＞0．05），表明此时肌卫星细胞增殖最多；到运动后48 h，肌卫星细胞的增殖肌卫星细胞的增殖指数比运动后24 h减少（P＜0．05），但还未恢复到对照组（P＜0．05，表 2）。

Tab．2 Proliferation index（pI）of skeletal muscle cell in different restoration stages（%，¯x±s，n＝10）

Fig．2 Diagram of correlation between AI and PIAI：Cell Apoptosis apoptosis index；PI：Proliferation index

2．3 细胞凋亡指数与增殖指数的相关性分析

利用简单相关分析，发现骨骼肌卫星细胞增殖指数与骨骼肌细胞凋亡指数呈中度正相关（P＜0．05）。说明离心运动后凋亡与增殖存在一定的关系。

3 讨论

3．1 离心运动对骨骼肌细胞凋亡的影响

凋亡作为程序性死亡的一种特殊方式在生长、发育调节和疾病中发挥着重要角色。很多证据表明细胞凋亡在骨骼肌细胞损伤的病理生理中扮演着重要的角色。骨骼肌细胞凋亡存在于肌肉萎缩、慢性心肌疾病的骨骼肌中、骨骼肌失神经、骨骼肌失重、退用以及急性运动中。在运动过程中和运动后，骨骼肌和心肌的自发性凋亡是短期或长期的运动性骨骼肌损伤一个特殊致病原因。

ARSLAN［4］等人经过实验发现 Wistar大鼠在经过轮内自发跑运动后，利用TUNEL法测量凋亡指数，运动后即刻比目鱼肌细胞凋亡核显著上升，由安静时的 0．98×10-3±1．83×10-3上升到 3．03×10-3±2．78×10-3，运动后 24 h凋亡核上升到 4．48×10-3±3．32×10-3。Boffi［5］等对纯种马进行了三个月的跑台训练，在肌肉活检中，发现运动训练组的肌细胞凋亡显著性高于控制组（P＜0．01），并推测正是新生的更具生命力的细胞不断代替凋亡的异常肌细胞这一过程，是训练导致体能增长的机制。我国学者通过实验发现运动训练后大鼠骨骼肌细胞凋亡明显增加，1周后达到高峰，2周、3周后下降［6］。王长青等对大鼠进行了为期1 d、6 d、12 d和18 d的运动训练，运动训练结束后40 min取材，用流式细胞技术和TUNEL法检测骨骼肌细胞的凋亡情况，研究发现对照组骨骼肌组织中有自发性细胞凋亡发生，但百分比很低，而运动训练可使骨骼肌细胞凋亡的比例增加，其中以训练6 d组骨骼肌细胞凋亡的比例最高［7］。本实验结果表明，大鼠在经过3 d重复性力竭运动后，骨骼肌细胞核发生了凋亡，其凋亡指数在运动后即刻明显升高，运动后24 h达到峰值，运动后48 h凋亡指数有所下降，与对照组有显著的差异。也就是说细胞凋亡出现了明显的时序性，而且与运动性骨骼肌微损伤的时序性一致。那么这种结果出现的原因是什么呢？综合前人的研究成果，分析如下：

离心运动致骨骼肌细胞凋亡时序性变化的可能机制为：（1）离心运动导致胞浆内Ca2＋浓度升高，引起中性蛋白酶活性增强使结构破坏而形成骨骼肌损伤。而胞浆内钙浓度大幅度增加引发细胞一系列生理、生化反应，如通过激活蛋白酶，如钙蛋白酶、核支架蛋白酶、死亡相关蛋白激酶等，谷氨酰胺转移酶，凋亡相关基因，以及核酶（包括内切酶、拓扑异构酶）等从而介导细胞凋亡。（2）胞浆内Ca2＋浓度升高使线粒体Ca2＋超载导致线粒体膜通道的改变、自由基的释放、线粒体膜电位的下降及细胞色素C的释放，抑制ATP的生成，进而抑制氧化磷酸化，从而引起细胞凋亡。（3）由于离心运动导致肌浆网释放出大量的钙，以及肌浆网内Ca2＋转运能力下降，包括钙释放通道钙释放能力和钙泵逆浓度梯度摄钙能力都下降，所以内质网内的钙得不到及时的补充而减少，从而导致细胞凋亡。（4）离心运动使机体产生的自由基不仅通过脂质过氧化损伤细胞膜和内膜系统，造成细胞凋亡，同时使蛋白质和酶分子失活，损伤线粒体DNA，调节凋亡相关基因的表达等诱导细胞凋亡。（5）HSP与细胞凋亡关系密切，尤其HSP70、HSP27对热休克、氧化应激、电离辐射、FNF-α等引起的细胞凋亡有保护作用，可抑制诱导的蛋白激酶激活、抑制凋亡基因P53和Bax的表达、抑制凋亡信号转导中的蛋白水解酶和抑制氧自由基生成以及对细胞线粒体功能的保护作用有关，运动后即刻，HSP27很强的表达［8］，抑制了细胞凋亡。随着时间的延长，HSP27的表达逐渐减少，细胞凋亡加剧。

3．2 离心运动对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响

肌卫星细胞是位于基膜与细胞膜之间的一群单核细胞，紧贴于肌细胞表面，胞核扁圆。在正常状态下处于静止期，当肌肉损伤、坏死或负荷过重时，该细胞被激活，开始增殖（有丝分裂）、分化（功能蛋白的表达）并融合成肌管，或迁移到受损的肌管处，最后形成新的肌纤维或修复受损的骨骼肌纤维。结果是产生新的肌细胞核保持细胞核的稳态，或使骨骼肌肥大或修复被损的肌纤维或聚集成肌管形成新的肌纤维。目前的研究认为肌卫星细胞增殖一般在运动后24 h到7 d之内。

本实验利用免疫组织化学方法测量PCNA的表达，结果是肌卫星细胞的增殖运动后即刻和运动后24 h两个高峰期。运动后即刻肌卫星细胞增殖指数明显高于对照组，同时电镜发现运动后即刻出现了成肌细胞与骨骼肌融合现象；运动后3 h，肌卫星细胞的增殖指数反而下降；运动后24 h肌卫星细胞增殖最多；到运动后48 h，肌卫星细胞的增殖减少，但还未恢复到对照组。

此次运动是重复三天力竭性离心运动，运动后即刻卫星细胞增殖较多，而且电镜发现运动后即刻肌卫星细胞增殖的同时出现了成肌细胞，原因有二：一是前两天的离心运动导致肌卫星细胞已经增殖；二是成肌细胞有两类前体细胞［9］，一般意义的肌卫星细胞和执行卫星细胞，一般意义的卫星细胞处于静止状态，受刺激后激活、增殖、分裂后一个子细胞作为成肌细胞，另一个子细胞保留下来作干细胞；执行卫星细胞的特点是在特殊情况下可以不经有丝分裂，直接分化成成肌细胞。运动后即刻执行卫星细胞很快分化，所以运动后即刻卫星细胞增殖增多。但是在运动后3 h，肌卫星细胞增殖数量反而下降，可能是前两次运动激发的肌卫星细胞增殖已经开始下降，而第三次运动激发的卫星细胞增殖还未达到高峰。

3．3 骨骼肌细胞凋亡与增殖的相关性分析

肌卫星细胞增殖与骨骼肌细胞凋亡呈正相关，说明凋亡与增殖存在一定的关系。细胞凋亡后，巨噬细胞增加。有人把从大鼠无菌性腹膜炎经腹腔灌洗而获得的含大量巨噬细胞的腹腔渗出液加入大鼠成肌细胞原代培养物中，发现巨噬细胞与成肌细胞混合培养能明显提高成肌细胞有丝分裂及分化融合形成肌小管的能力。说明巨噬细胞能分泌一种选择性因子刺激成肌源性细胞增殖、分化，启动再生形成肌纤维的过程［10］。骨骼肌细胞凋亡可能是启动肌卫星细胞增殖的因素，凋亡细胞的增多，导致巨噬细胞活性增强，巨噬细胞分泌选择性因子，刺激成肌源性细胞分裂，导致细胞增殖。但是其过程及机制如何还有待进一步研究。

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