Gemini表面活性剂对类脂囊泡理化性质及pH敏感性的影响＊

王慧云

（济宁医学院药学院，山东日照276826）

由于人体病理组织如炎症或感染区域，某些肿瘤组织或局部缺血时会出现异常酸化现象，从而导致了其pH值较正常组织的pH偏低[1－4]。基于此生理特点pH敏感药物传递系统应运而生，它可以通过环境pH值的变化，实现药物的控制释放，或者根据病变部位与机体正常生理状态pH值差别而实现靶向给药[5]，减少药物的不良反应[6－7]，其研究和应用近年来受到了国内外的广泛关注[8－9]。其中pH敏感类脂囊泡由于其具有较pH敏感脂质体更高的稳定性而成为新型药物传递系统领域的一大亮点[10]。pH敏感类脂囊泡的制备通常由非离子表面活性剂与胆固醇及pH敏感物质共同组成[11－16]。非离子Gemini由2个亲水基和2个疏水基构成的一类新型表面活性剂，具有高表面活性、生物安全性及传统表面活性剂良好的协同作用等特点[17－18]。然而关于非离子Gemini表面活性剂对类脂囊泡理化性质及pH敏感性和稳定性的影响较少报道。本文利用Gemini表面活性剂与Tween 20胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯为囊材制备了pH敏感类脂囊泡，考察了Gemini表面活性剂对囊泡稳定性及pH敏感性的影响，旨在开发新型pH敏感药物传递系统及拓宽Gemini表面活性剂的应用领域。

1 实验部分

1.1 仪器与药品

1.1.1 仪器 JY92－Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；2X－2型旋片式真空泵（南京市真空泵厂）；8010型搅拌式超滤杯（MILLIPORE COMPANY）；RE－52AA涡旋混合器（上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水真空泵（郑州市长城科工贸有限公司）；Zetasizer Nano ZS90（英国，Malvern）；F－4600荧光分光光度计（Hitachi High－Technolodies Corporation Tokyo Japa）；LC－10AT高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）；N－2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息程研究所有限公司）；ZRS－8G智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）。

1.1.2 药品 吐温20（上海山浦化工有限公司）；2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性剂）（Sigma－Aldrich）；胆固醇半琥珀酸酯（CHEMS）（Sigma）；胆固醇（CHOL）（AR，上海蓝季科技发展有限公司）；8－羟基－1，3，6－芘三磺酸三钠（HPTS）（sigma）；胎牛血清（上海劲马生物科技有限公司）；三氯甲烷（AR，江苏南京中山集团公司化工厂）；甲醇（AR，江苏南京中山集团公司化工厂）；醋酸缓冲溶液（pH 5.4，北京百汇生物科技有限责任公司）；磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4，LR，北京索宝生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 pH敏感类脂囊泡的制备与纯化 采用薄膜水化—超声法制备制备pH敏感类脂囊泡，取适量的表面活性剂Tween20、Gemini与胆固醇以及pH敏感物质胆甾醇半琥珀酸酯按照一定的配比溶于氯仿和甲醇的混合液中，使其溶解，利用旋转蒸发仪于适当温度下旋转蒸发成膜，然后加入含有荧光探针HPTS的缓冲溶液水化，将得到的混悬液于常温水浴中超声处理5min（超声功率400 W，间隔3s，工作3s），即得到pH敏感型HPTS囊泡混悬液。囊泡的纯化：应用美国MILLIPORE公司的搅拌式超滤杯，加入囊泡混悬液后，向容器内通入氮气提高超滤压力，同时开启磁力搅拌，游离药物和溶剂分子被挤压排出超滤膜外。

1.2.2 囊泡粒度和zeta电位的测定 利用动态光散射（DLS）测定囊泡大小及电位：将囊泡混悬液超声处理后，用缓冲溶液稀释，再经微孔滤膜过滤后，放入Zetasizer Nano ZS 90纳米粒度zeta电位分析仪样品池中，于25℃，散射角为90.0°条件下测定囊泡大小及分散指数。将样品放入U型样品池中测其zeta电位。

1.2.3 囊泡包封率的测定 将载药囊泡用磷酸盐缓冲液水化，超声混匀，立即倒入超滤杯进行超滤，取出滤液，用HPLC进行测量，此浓度为C剩余，即未包入囊泡的游离药物，求出样品中未包入囊泡的药物的质量D剩余，再求出药品中投入药物总量D总，代入下式即可求出包封率。

高效液相参数：色谱柱为C18色谱柱（250mm ×4.6mm，5μm）。流动相为甲醇和磷酸盐缓冲液，二者体积比为50∶50，超声0.5h脱气。紫外检测波长246nm，流速1.0ml／min。进样量20μl，柱温为室温。

1.2.4 囊泡形态的测定 取囊泡混悬液少许滴于载玻片上，加盖玻片，加1滴香柏油，于光学显微镜下观察，接数码相机拍照。囊泡在显微镜下的形态如图1所示。

图1 囊泡的光学显微镜照片（×4000）

由图1可见，所制得的类脂囊泡为球形，具有明显的双层膜结构。

1.2.5 类脂囊泡体外pH敏感性的考察 载药囊泡在不同pH环境中释放速率：将超滤后的囊泡放入透析袋中，然后放入装有250ml pH7.4或pH5.4的缓冲溶液的智能溶出仪烧杯中，透析袋置于搅拌浆的下端，设定温度为37℃，转速为50 r／min，模拟体内环境进行药物缓释性实验。于1～8h每小时取样1次，吸取释放液5ml，同时补充5ml缓冲溶液。释放液用高效液相色谱法检测峰面积，从而求得HPTS的累积释放度。

血清对类脂囊泡稳定性和pH敏感性的影响：将适量pH敏感类脂囊泡混悬液加入含有50%胎牛血清的缓冲溶液中，培育2h后用pH＝7.4的PBS缓冲溶液和pH＝5.4的醋酸缓冲溶液稀释100倍，然后利用F－4600荧光分光光度计测定其荧光强度，温度25℃、发射波长为510nm，用2.5nm的狭缝宽度，在300～600nm范围内以10nm／min的速度扫描，扫面出最大激发波长后，再固定激发波长。通过测定不同pH下囊泡的荧光强度及包载物质的累积释放量来考察囊泡的pH敏感性。

1.3 各因素对类脂囊泡的影响

1.3.1 CHEMS对类脂囊泡理化性质及包封率的影响 文献[19]报道，在非离子表面活性剂囊泡的制备中加入CHEMS可改变膜的流动性，该功能与加入胆固醇相似，因此在实验中保持胆固醇和CHEMS的总量不变，但改变胆固醇和CHEMS的比例，考察不同pH下CHEMS对囊泡理化性质及包封率的影响。Tween 20∶Gemini∶（CHOL＋CHEMS）为0.5∶0.5∶1.

1.3.2 Gemini表面活性剂对类脂囊泡理化性质及包封率的影响 固定Tween 20、胆固醇、CHEMS的量（分别为100nmol、50nmol、50nmol），考察不同Gemini表面活性剂的量分别（0nmol、20nmol、40nmol、60nmol、80nmol、100nmol、150nmol）对囊泡理化性质及包封率的影响。

1.3.3 Gemini表面活性剂对类脂囊泡pH敏感性的影响 筛选出一定配比的囊泡体系，分别考察不同pH下含有及不含Gemini表面活性剂的囊泡体系所包载物质的释放行为及粒度变化，并进一步考察胎牛血清蛋白对该类囊泡体系稳定性及pH敏感性的影响。

2 结果与讨论

2.1 CHEMS对类脂囊泡理化性质及包封率的影响

CHEMS对类脂囊泡粒度、分布指数、电位及包封率的影响，结果见表1。

表1 不同pH条件下CHEMS对囊泡粒度、zeta电位、PDI的影响

由表1可见，修饰有CHEMS的囊泡粒度大小及表面电荷明显收到pH的影响，但在相同pH条件下，随CHEMS量的增加粒度变化并不显著，但电位明显随CHEMS的增加而增加。相同CHEMS含量条件下，囊泡的粒径随pH的降低而增加，电位随pH降低显著减小，PDI也随pH的降低而增加，说明加入CHEMS后囊泡在较低pH条件下稳定性降低。这是由于CHEMS是一种pH敏感分子，当处于酸性环境中时，由于CHEMS的极性头基发生质子化或水化，从而降低了zeta电位及脂质膜的稳定性，膜失稳后可能导致两亲性分子的重组，电位的降低将导致囊泡的聚集，从而使得其粒度及分布系数有较大变化。

2.2 Gemini表面活性剂对类脂囊泡理化性质及包封率的影响

Gemini表面活性剂对类脂囊泡理化性质及包封率的影响结果见表2。

表2 Gemini表面活性剂对pH敏感类脂囊泡粒度、PDI、电位及包封率的影响

由表2可见，随Gemini表面活性剂用量的增加，体系粒度值略有增加，zeta电位并没有发生明显变化，但PDI值变化较明显，随Gemini表面活性剂用量的增加PDI总体变化趋势是先降低后增加，体系的包封率也随着Gemini表面活性剂用量的增加而增加，但增加到一定值后基本不再发生明显变化，甚至略有降低。

出现这些现象的原因可能是，这可能是由于非离子Gemini表面活性剂具2个亲水基和2个疏水基，有较强的表面活性，分散能力较传统表面活性剂强，且连接基团插入囊泡双层膜中进一步增加了膜的稳定性，从而增加了其包封率及粒度分布的均匀性。当浓度过高时，由于Gemini表面活性剂的强分散能力，使其与Tween 20及胆固醇／胆甾醇半琥珀酸酯之间的协同成膜能力降低，包封率随Gemini表面活性剂浓度的增加反而降低。

2.3 Gemini表面活性剂对类脂囊泡pH敏感性的影响

选择处方为Tween20 50nmol、胆固醇50nmol CHEMS 50nmol、Gemini 50nmol囊泡体系，分别将其放入pH7.4的磷酸盐缓冲溶液及pH5.4的醋酸缓冲溶液中，测定HPTS在不同pH条件下的累积释放曲线。结果见图2。

图2 类脂囊泡体系在不同pH条件下的释药行为

由图2可见：2种pH敏感类脂囊泡在较低pH条件下药物快速释放，而不含CHEMS的类脂囊泡，HPTS释放较慢，对药物具有一定缓释作用。含有Gemini表面活性剂的类脂囊泡其释放速率在2种pH条件下均较不含Gemini体系略低，可能是由于在实验条件下，Gemini表面活性剂与处方中其他处分间产生协同效应，从而使得类脂囊泡的膜更紧密，从而导致了其释放速率减小，但从图中可见，Gemini表面活性剂的存在对类脂囊泡的pH敏感度影响不大。

胎牛血清对含Gemini表面活性剂pH敏感类脂囊泡稳定性及pH敏感度的影响结果见图3。

图3 pH敏感类脂囊泡在不同pH值下的荧光强度与随pH值的变化

由图3可见，经过胎牛血清培育2h后，pH敏感类脂囊泡在较低pH下，荧光强度显著降低，说明体系仍具有较好的pH敏感性。相对来说，含有Gemini表面活性剂的pH敏感类脂囊泡，经过牛血清培育后其pH敏感程度相对不含Gemini体系来说略有降低，但影响不是太大。可能是由于Gemini表面活性剂与处方中其他成分存在较强的协同效应，构成的双层膜的稳定性较强，从而使得荧光物质不宜泄漏，故其在较低pH条件下，囊泡的荧光强度高于pH敏感非离子表面活性剂囊泡体系。

3 结论

Tween 20表面活性剂与2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性剂）、胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯可形成粒度大小合适、分布均匀、包封率高、pH敏感性强的类脂囊泡，CHEMS的加入，对囊泡的粒度没有明显影响，但却可显著增加其zeta电位和pH敏感性。Gemini可增加pH敏感类脂囊泡的均匀度及包封率，对其pH敏感性影响不大，因此pH敏感Gemini类脂囊泡将成为一种非常有潜力的靶向药物传递系统。

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