黄金蒲桃组织培养初步研究

莫健斌，陈文燕，马 斌，潘国平

(暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632)

黄金蒲桃(Xanthostemon chrysanthus F.Muell. ex Benth)，桃金娘科植物，常绿乔木，原产澳大利亚，是澳洲特有的代表植物之一，为昆士兰省凯恩斯市(Cairns)市花。花初开时黄绿色，随着开花时间延长，转为黄色，凋谢时为金黄色。整团花序远观有如绒球，是花色特殊的珍奇花木。黄金蒲桃树形优美，木质相当好，为首选的园景木和行道树之一，具有较高的经济价值。黄金蒲桃在中国引种范围十分狭小，仅在福建、广东等少部分地区有栽种。地域、气候等差异引起黄金蒲桃花期缩短，结实率不高，被称为黄金熊猫。目前黄金蒲桃的繁殖主要为传统的播种方式，此方式繁殖率低，生长周期长，不能满足经济发展的需要。利用组织培养技术快速繁殖黄金蒲桃，可以克服乔木生产短缺的不足，在短时间内大量繁殖组培苗，供生产上使用。本研究不仅在黄金蒲桃的商品化上具有一定的实践意义，而且为木本植物的离体快速繁殖提供理论及实践指导。本试验通过对黄金蒲桃初代培养的研究，为黄金蒲桃的深入研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

选取地点为暨南大学生命科学技术学院，具有20 a树龄黄金蒲桃的未老熟枝条。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 黄金蒲桃的酚化合物含量高，容易引起褐变[1-2]。阴雨天气采摘的外植体褐变率十分高，因此采摘外植体时最好是选择艳阳天。老化的枝条褐变率高，且不易脱分化和再分化，应选择新生的带红色嫩叶的枝条[3-4]，同时，过嫩的枝条在培养过程中容易死亡，采摘时也不宜选择太嫩的枝条，枝条的长度为4 cm即可。采摘好的枝条用自来水冲洗30 min，冲洗过后，用洗衣粉液浸泡10 min，将浸泡后的枝条用自来水冲洗干净。取干净的烧杯，将处理好的枝条置于烧杯中，用Vc浸泡2 h，随后，再置于冰箱中冷藏12 h。取出冰箱中的材料，将其转移到干净的无菌操作台，用73%的酒精浸泡外植体30 s，确保酒精覆盖了外植体，同时不停地摇晃烧杯，用无菌水冲洗外植体2次，然后用HgCl2浸泡10 min，同时不停摇晃，后用无菌水冲洗8次左右。用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干，待接种在培养基上。

1.2.2 不同条件对启动培养的影响

(1)不同消毒条件对启动培养的影响。探讨不同质量分数的氯化汞溶液处理茎段对启动培养产生的影响，选取长势相同、已预处理过的黄金蒲桃茎段分别浸泡于0.1%和0.5%的氯化汞溶液中，浸泡时间均为10 min。30 d后观察试验结果并统计。

(2)不同pH对启动培养的影响。培养基中不同的pH值会影响植物的生长[5]，将培养基的pH值分别调为5.0和6.0，再将带腋芽茎段的黄金蒲桃分别接种到这2种培养基中，30 d后观察试验结果。

(3)不同季节对启动培养的影响。分别在夏季(即2012年6，7，8月)和冬季(2012年12月、翌年1，2月)接种黄金蒲桃带腋芽茎段。30 d后观察实验结果并统计。

1.2.3 不同条件对芽诱导的影响

(1)不同基本培养基对芽诱导的影响。黄金蒲桃为木本植物，选取适合木本植物组织培养的WPM[6]和Andersson配方做为茎段诱导的基本培养基。分别将黄金蒲桃带腋芽茎段接种在这2种基本培养基上，30 d后观察试验结果并统计，比较这2种培养基对启动培养的影响。

(2)不同取材部位对芽诱导的影响。植物不同部位在相同的培养条件下，芽诱导率和死亡率有所差异，试验选用顶芽和茎段作为芽诱导的材料，比较2者对芽诱导的影响。30 d后观察试验结果并统计。

(3)不同质量浓度植物生长调节剂组合对芽诱导和丛芽生长的影响。将黄金蒲桃带腋芽茎段接种于每种激素组合的培养基中，每个因素设置3个质量浓度水平，因素水平见表1，每瓶接种1个茎段，每一组合接种20瓶，重复3次，30 d后观察试验结果并统计，所有的值取3次试验的平均值，利用SPSS软件分析不同质量浓度植物生长调节剂组合对芽诱导的影响。

表1 不同质量浓度的植物生长调节剂组合 mg/L

如无特别说明，以上培养基均以Andersson配方为基本培养基，培养基含有30 g/L的蔗糖、8 g/L的琼脂，0.5 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的NAA，pH在6.0±0.2之间。光照强度为1 500 lx，光照时间24 h，温度为25℃。将处理好的无菌外植体在无菌操作台切成1 cm左右，再将带1个腋芽的茎段接种在Andersson配方培养基中，每瓶培养基接种1个茎段。

1.3 试验器材

试验所需的基本器械有镊子、解剖刀、三角瓶、剪刀，高压灭菌锅，培养箱等。所有的试验器械在无菌操作前均要进行灭菌工作。

1.4 数据分析

所有的试验结果采用 SPSS19.0软件及 ex-cel2003进行分析，所用的方法为卡方检验法(Chisquare test)。激素质量浓度组合对芽诱导和丛生芽生长的影响用邓肯新复极差检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒条件对启动培养的影响

不同质量分数的氯化汞处理茎段后，对启动培养的影响见表2，结果表明，褐变率差异达到显著水平(x2=4.667，P＜0.05)，消毒液质量分数越低，褐变率越低;污染率的差异达到极显著水平(x2= 7.461，P＜0.01)，质量分数越低，污染率越高。说明要让茎段处理后褐变率低、污染率低，则必须控制好氯化汞的质量分数，由于氯化汞质量分数对污染率的影响相对对褐变率的影响较大，为了使试验获得较多的无菌苗，可适当提高氯化汞质量分数，但不能超过0.5%。

表2 不同质量分数的氯化汞溶液对启动培养产生的影响

2.2 不同pH对启动培养的影响

试验结果表3，不同pH的褐变率差异达到显著水平(x2=5.556，P＜0.05)，pH越低，褐变率越高;不同 pH的污染率差异也达到显著水平(x2= 5.922，P＜0.05)，pH越低，污染率越低，这可能是低的pH值不适合杂菌的生长，因此，在pH较低的环境中，污染率也较低。说明要让茎段处理后褐变率低、污染率低，则必须控制好pH，由于在低pH环境中，会使茎段长芽的时间延长，为了快速繁殖无菌苗，pH最好采用6.0。

表3 不同的pH值对启动培养产生的影响

2.3 不同季节取材对启动培养的影响

分别在夏季和冬季取材，处理茎段后，对茎段进行离体培养，不同季节取材对启动培养产生的影响见表4，结果表明，不同季节取材对褐变率的影响达到了极显著水平(x2=42.593，p＜0.01)，夏季的褐变率明显高于冬季;不同季节取材对污染率的影响也达到了极显著水平(x2=15.686，p＜0.01)，夏季的污染率明显高于冬季。可见，虽然外植体是在恒温箱中培养的，但由于外植体是在不同季节摘取的，即接受了不同的自然光照时间长度和不同温度条件等，因此，对试验无菌苗的获取率也有影响，为了获得更多的无菌苗，黄金蒲桃的离体培养适合在冬天进行。

表4 不同季节对启动培养产生的影响

2.4 不同基本培养基对芽诱导的影响

不同的培养基对离体组织的芽诱导效果有差异，试验结果表明，在接种了100个相同的茎段后，WPM和Andersson培养基可获得的无菌无褐变茎段数分别为37，34个，芽诱导数分别为23，25个，经卡方检验，WPM和Andersson培养基对芽诱导的影响没有明显的差异(x2=1.045，p＞0.05)。说明这2种培养基均可以作为诱导黄金蒲桃茎段长芽的基本培养基。

2.5 不同取材部位对芽诱导的影响

取材部位不同，其分化的程度不同，因此对芽诱导也有所影响，试验结果表明，在接种了100个顶芽和茎段后，褐变数分别为44，32个，污染数分别为19，34个，无菌无褐变数分别为37，34个，芽诱导数分别为31，28个。经卡方检验，不同取材部位对褐变率的影响没有明显的差异(x2=3.056，p＞0.05)，对芽诱导数的影响也没有显著差异(x2=0.026，p＞0.05)，对污染率的影响有显著的差异(x2=5.776，0.01＜p＜0.05)。说明顶芽的杂菌相对茎段比较少，但黄金蒲桃的顶芽在离体培养过程中较容易褐变死亡，而褐变是黄金蒲桃较难攻克的问题，因此，茎段仍是目前较为理想的试验材料。

2.6 不同植物生长调节物质对芽诱导的影响

植物生长调节物质对芽诱导的影响见表5，根据方差分析结果表明，低质量浓度的6-BA、NAA、IBA组合均有利于芽的诱导和丛生芽的生长，6-BA质量浓度的变化对芽的诱导和丛生芽的生长有着极显著的影响，而NAA只对芽的诱导有显著的影响，IBA对芽的诱导和丛生芽的生长均没有显著的影响，说明在芽诱导过程中，细胞分裂素起着重要的作用。生长素对芽的诱导也有促进作用，但效果没有细胞分裂素明显，且高质量浓度的生长素容易抑制芽的诱导。此外，6-BA与NAA组合效果比6-BA与 IBA组合效果好。在黄金蒲桃芽的诱导和丛生芽的生长过程中，最适宜的植物生长调节物质质量浓度组合为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其芽诱导率高达91.3%，每个茎段平均丛生芽数为3.2。

表5 不同植物生长调节物质对芽诱导的影响

3 讨论与小结

从试验结果可知，适当提高氯化汞的质量分数可以获得较多的无菌苗，同时要控制好氯化汞的质量分数，因为氯化汞质量分数越高，褐变率也越高。pH能影响褐变率和污染率，pH越低，污染率越低，褐变率越高，培养黄金蒲桃组培苗适宜的pH为6.0。黄金蒲桃外植体在夏季的污染率和褐变率都特别高，可能原因是，夏季取材时，外植体在自然光照条件下，光照较充足，且夏季温度较高，这些因素均有利于提高植物体内酚类酶活性，因而夏季褐变率会相对较高。与此同时，冬季取材，外植体的褐变率和污染率都相对较低，因此黄金蒲桃适宜在冬季进行组培试验。WPM和Andersson培养基都是适合乔木组培的基本培养基，通过比较分析，发现这2种培养基对黄金蒲桃外植体培养的影响无明显的差异。顶芽和茎段对褐变率的影响没有显著的差异。取材部位越嫩，污染率会低，可能原因是顶芽的杂菌较少，而茎段的筛管组织内本身就存在着杂菌，此不能通过氯化汞等消毒剂在体外除去的，因此，其污染率会比顶芽高点。试验研究过程中发现，虽然顶芽污染率低，但其死亡率比茎段要高得多，最终收获的无菌无褐变数相对也会较少，因而茎段是黄金蒲桃组培理想的取材部位。外源植物生长调节剂是影响植物芽诱导的重要因素，低质量浓度的细胞分裂素类物质和生长素类物质组合能够有效诱导芽的生长。 6-BA对芽诱导的影响最大。适当的6-BA和 NAA组合能促进芽的诱导，其芽诱导率最高能达91.3% 。最佳质量浓度植物生长调节剂组合为0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

木本植物的生长周期长，组培是进行木本植物最为有效的一种快速繁殖技术方法，但木本植物组培比草本、藤本等困难得多。目前世界上成功快速繁殖出木本植物的只有100多例[7]。本试验首次对黄金蒲桃进行了组织培养研究，并成功诱导出大量丛芽，为进一步建立该树种完整的组培快繁体系奠定了基础。

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