沙格雷酯对野百合碱模型大鼠肺动脉高压的改善作用及对肺动脉NFAT3表达的影响

韩俊丽，田红燕，迟丽屹，刘 亚，王文平，吕 颖，闫晓丽，张再伟，田 华，范粉灵(西安交通大学医学院第一附属医院心内科，西安 7006;西安交通大学医学院第二附属医院重症医学科;解放军5医院神经内科;陕西省人民医院心内科;通讯作者，E-mail:tianhhyy@mail.xjtu.edu.cn)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)死亡率高、预后差。肺动脉重构是肺动脉高压的主要病理改变之一［1］。肺动脉重构包括中膜、外膜增厚，使远端小动脉异常肌化，导致管腔狭窄和阻力增高。5-羟色胺(5-HT)既是一种单胺类神经递质，也是一种重要的血管活性物质，可调节血栓和止血，并作用于内皮细胞和平滑肌细胞，促进细胞增殖［2，3］。5-HT通过 5-HT 受体和 5-HT 转运体发挥作用。研究表明肺动脉高压病人和动物模型的血浆中5-HT 水平增高［4，5］，5-HT 受体和 5-HT 转运体表达增高［6］。抑制5-HT受体可改善模型动物的PAH程度［7］。5-HT 受体家族包括 5-HT1-5-HT7。5-HT2受体家族有 3个亚型，5-HT2A、5-HT2B和 5-HT2C［8］。5-HT2A受体广泛分布于心血管系统，在平滑肌细胞和血小板中都有分布［9，10］。活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedT-cells，NFAT)通路控制心血管系统发生过程中的许多步骤，包括心脏瓣膜形成及周围血管的形成等。NFAT家族有5个亚型，NFATc1-c5［11］。PAH 时 NFATc2 及 NFATc3表达增高，活化后与核内促增殖和抑制凋亡的基因序列结合，促进肺血管重构［12］。

传统的5-HT2A受体拮抗剂可抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和肺动脉收缩，但对肺动脉高压的改善作用有限［6］。沙格雷酯是一种新型的5-HT2A受体拮抗剂，用于缺血性疾病的治疗［10］，如动脉硬化闭塞。本研究采用野百合碱诱导的PAH大鼠模型，观察了沙格雷酯对PAH的改善作用，以及对肺动脉NFAT3表达的影响，以期为寻找PAH新治疗靶点提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

18只SD雄性大鼠150-200 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。

1.2 主要实验仪器设备

高速低温离心机，凝胶成像分析系统ChemiDocTM(Bio Rad公司)，BL-420E生物信号采集系统(成都泰盟公司)，HX-200动物呼吸机(成都泰盟公司)，正置显微镜(Olympus公司)。

1.3 主要试剂

野百合碱(monocrotaline，MCT，Sigma 公司)，沙格雷酯(sarpogrelate，三菱株式会社)，NFAT3兔抗小鼠多克隆抗体(Anbo公司，B0521)，GAPDH兔抗大鼠单克隆抗体(Epitomics公司，2251-1)，二抗为HRP标记的羊抗兔多克隆抗体(Abcam公司，ab6721)

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组 分为对照组(control组)、野百合碱诱导的肺动脉高压模型组(MCT组)和沙格雷酯干预组(sarpogrelate组)，每组6只。干预方法如下:①对照组第1天腹腔注射生理盐水，自腹腔注射生理盐水第2天开始每天生理盐水灌胃;②MCT组第1天腹腔单次注射野百合碱(MCT，50 mg/kg)建立PAH模型［13］，自腹腔注射野百合碱第2天开始每天生理盐水灌胃;③Sarpogrelate组第1天腹腔注射野百合碱，自腹腔注射野百合碱第2天开始每天沙格雷酯灌胃(100 mg/kg)。三组干预4周后进行肺动脉压力测定和取材。

1.4.2 肺动脉压力测定 大鼠以10%水合氯醛常规腹腔麻醉后，仰卧位，固定四肢和门齿。切开气管，置入气管插管，固定牢固，连接小动物呼吸机(潮气量 4-6 ml，呼吸频率 60次/min，吸呼比4∶5)。纵行剪开胸部皮肤，将胸前肌肉掀至一侧。沿第3、4肋间隙分开肋间肌，将上下两侧肋骨拉开，暴露出肺动脉。取留置针穿入肺动脉，拔出针芯，留置针另一端接张力换能器，将信号输送至BL-420E生物信号采集系统。计算平均肺动脉压力。

1.4.3 取材及染色 压力记录完毕后，取出心肺组织。剥离肺动脉并留取肺组织，液氮冻存。分离右室、左室+间隔，分别称重。以右室重/(左室重+间隔)计算右心指数。肺组织切取外周部分做常规HE染色。以2×肺动脉壁厚/肺动脉外径评价肺动脉重构程度。

1.4.4 Western blot 取约50 mg肺动脉组织，SDS裂解液冰上裂解。离心后测蛋白浓度。将蛋白原液立即-80℃保存，或变性后进行下一步Western blot实验。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转印至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉室温慢摇封闭1 h。加一抗(NFAT3兔抗小鼠多克隆抗体，1∶500)孵育过夜。TBST洗后加二抗(HRP标记的羊抗兔多克隆抗体，1∶5 000)室温慢摇孵育1 h。TBST洗后，将化学发光液A液和B液等体积混合，覆盖于硝酸纤维素膜上反应3-5 min。放入凝胶成像系统成像。Quantity One软件进行图像分析。

1.5 结果统计与分析

2 结果

2.1 沙格雷酯对平均肺动脉压力的影响

沙格雷酯对肺动脉测压波形的影响见图1。与对照组相比，野百合碱模型组的平均肺动脉压力升高(见图2);沙格雷酯干预组的平均肺动脉压力较野百合碱模型组降低，但仍比对照组高;均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 沙格雷酯对右心指数的影响

以右室重/(左室重+间隔)表示右心指数，简写为RV/(LV+S)，可反映右室重构程度和肺动脉高压的严重程度。野百合碱模型组的右心指数较对照组增高，沙格雷酯干预组的右心指数较野百合碱模型组降低，但仍高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图3)。

2.3 沙格雷酯对肺动脉重构的影响

图1 沙格雷酯对肺动脉压力的影响Figure 1 Effect of sarpogrelate on pulmonary artery pressure wave

图2 沙格雷酯对平均肺动脉压力的影响 (n=6)Figure 2 Effect of sarpogrelate on mean pulmonary artery pressure (n=6)

图3 沙格雷酯对右心指数的影响 (n=6)Figure 3 Effect of sarpogrelate on right heart ratio (n=6)

肺组织HE染色显示，与对照组相比野百合碱模型组的肺动脉壁明显增厚，沙格雷酯干预后肺动脉壁增厚程度与野百合碱模型组相比明显减轻(图4A，B，C，见第750页)。以2×肺动脉壁厚/肺动脉外径评价肺动脉重构程度，进行定量分析，简写为2×壁厚/外径，统计结果显示有同样的改变趋势，沙格雷酯干预后肺动脉壁增厚程度较野百合碱模型组降低，但仍较对照组增高(P＜0.05，图4D，见第750页)。

2.4 沙格雷酯对肺动脉NFAT3蛋白表达的影响

与对照组相比，野百合碱模型组肺动脉NFAT3蛋白表达增高，沙格雷酯干预后NFAT3蛋白表达较野百合碱模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.05，见图5)。根据抗体说明书 NFAT3也即为NFATc4。

图4 沙格雷酯对肺动脉重构的影响 (HE染色，×20)Figure 4 Effect of sarpogrelate on pulmonary artery remodeling (HE，×20)

图5 沙格雷酯对肺动脉NFAT3蛋白表达的影响Figure 5 Effect of sarpogrelate on NFAT3 protein expression in pulmonary artery

3 讨论

5-HT是一种重要的神经递质和血管活性物质。循环中的5-HT主要储存于血小板中。损伤、缺血等因素可刺激血小板释放5-HT，作用于内皮细胞和平滑肌细胞［2，3］，内皮细胞也可产生 5-HT［6］。5-HT作为一种血管活性物质，在心血管系统中可引起血管收缩、细胞增殖、血小板聚集等［12］。5-HT通过5-HT受体和 5-HT转运体发挥作用［8，14］。5-HT及受体和转运体在PAH过程中起重要作用。研究表明PAH病人和PAH模型动物的血浆中5-HT水平增高［4，5］，5-HT 受体和 5-HT 转运体表达增高［6］。因此5-HT受体和5-HT转运体是PAH的治疗靶点，受到越来越多的研究关注。

5-HT受体分为7类，分别是5-HT1-5-HT7。5-HT2受体家族有3个亚型，分别为5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C［8］。5-HT2A受体不仅参与中枢神经系统和外周神经系统的病理生理过程，而且在心血管系统中广泛分布，参与心血管系统的病理生理过程［9，10］。5-HT2A受体在血管平滑肌细胞收缩、细胞增殖和迁移、血小板聚集、血栓形成和冠脉痉挛等过程中发挥作用［10］。本研究表明5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯可降低野百合碱诱导的PAH模型的肺动脉压力，减轻肺动脉壁增厚程度和右心指数。以往研究表明抑制5-HT受体可减轻肺动脉高压程度。Porvasnik等对一种新的5-HT2B受体拮抗剂PRX-08066的研究表明，在MCT诱导的PAH模型中，PRX-08066可降低肺动脉压力、右室重和右室肥厚，减轻肺动脉重构，增加右室射血分数，并且可升高左室舒张容积、收缩容积、射血容积［15］。Morecroft等研究表明5-HT1B受体拮抗剂LY393558可降低PAH模型的右室压力、右心指数和肺动脉重构，抑制5-HT引起的肺动脉收缩，抑制5-HT对来源于肺动脉高压病人的肺动脉平滑肌细胞的促增殖作用［16］。Dumitrascu等研究发现5-HT2A/B受体拮抗剂Terguride可减轻野百合碱诱发的大鼠肺动脉压力增高，并且Terguride可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移［17］。传统的5-HT2A受体拮抗剂如ketanserin改善PAH的作用有限［6］。沙格雷酯是一种新型的5-HT2A受体拮抗剂，用于缺血疾病的治疗，如用于慢性动脉硬化闭塞导致的疼痛、溃疡等缺血症状的治疗［10］。目前缺乏沙格雷酯用于肺动脉高压治疗的研究。Kato等研究表明对系统性硬化症伴有呼吸衰竭和右心衰竭的病人使用沙格雷酯后，可降低平均肺动脉压力，增加右室射血分数［18］。Hironaka等研究发现对野百合碱诱导的PAH模型大鼠使用沙格雷酯，可抑制肺高压的发展，增加生存率;肺组织的免疫组化结果表明沙格雷酯有抗炎、抗增殖作用;Western blot结果提示沙格雷酯可增加肺组织NO合酶的蛋白表达水平，表明沙格雷酯可能会改善内皮功能［19］。闫晓丽等研究结果表明沙格雷酯对肺动脉高压模型动物有改善作用，与本研究结果一致［20］。沙格雷酯的结构与ketanserin和其他5-HT2受体拮抗剂不同，可能因为这种化学结构的不同导致作用的差异［10］。在心血管系统中，沙格雷酯可抑制血管收缩、心肌肥厚和细胞增殖。Gong等研究表明沙格雷酯可抑制5-HT引起的冠状动脉收缩［21］，Ikeda等研究表明沙格雷酯有抑制心肌肥厚的作用［22］，Sharma等的研究表明沙格雷酯可抑制主动脉平滑肌细胞增殖［23］。

本研究还观察了沙格雷酯对肺动脉组织NFAT3表达的影响。结果表明野百合碱诱导PAH模型大鼠的肺动脉组织NFAT3蛋白表达增高，沙格雷酯可减低NFAT3蛋白表达。NFAT家族有5个亚型，NFATc1-c5。NFAT家族的共同特征包括N末端的NFAT同源结构域(NHR)和C末端的Rel同源结构域。NHR与调节功能有关，包括钙调神经蛋白的结合位点、核定位和核输出、一些丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化位点。Rel同源结构域介导 DNA结合［11］。本研究观察的 NFAT3即为 NFATc4亚型。有观点认为NFATc3是平滑肌细胞中的主要亚型，主要位于胞质中，也有认为培养的人肺动脉平滑肌细胞上表达NFATc4，还有认为大鼠主动脉平滑肌细胞主要表达NFATc1和NFATc2［24］。钙调神经磷酸酶(calcineurin)活化后，促进NFAT发生磷酸化，使NFAT转位至核内。在核内，NFAT与DNA序列结合，促进转录和细胞增殖［25］。PAH时存在NFAT表达和活性异常。Bonnet等的研究认为正常人和继发性肺动脉高压病人的肺小动脉低表达NFATc2。然而肺动脉高压病人的肺动脉高表达NFATc2。特发性肺动脉高压病人的肺动脉平滑肌细胞中，60%以上的细胞显示NFATc2活化，约20%显示NFATc3活化［12］。本研究结果显示 MCT诱导PAH模型大鼠肺动脉的NFAT3表达增高，与以往研究是类似的。NFAT是PAH发生机制中多种信号通路的共同的环节。NFAT抑制剂VIVIT可降低细胞内钙。特发性肺动脉高压病人的肺动脉平滑肌细胞存在线粒体超极化，可被 NFAT抑制剂 VIVIT逆转，并且VIVIT可以增加肺动脉平滑肌细胞凋亡、减少增殖［12］。因此抑制NFAT可能成为PAH治疗的新靶点。本研究中使用5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯，可下调PAH模型动物肺动脉组织的NFAT3蛋白表达，表明5-HT2A受体可能参与了PAH时NFAT3上调的过程。可能的解释为，5-HT2A受体被激活后，导致细胞内钙离子升高［10］，促使NFAT活化，转位至核内，与促进增殖和抑制凋亡的基因序列结合，引起细胞增殖［12，25］，最终导致肺动脉重构。

综上所述，本研究表明5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯可改善野百合碱诱导PAH模型大鼠肺动脉高压的程度，包括减低肺动脉压力、减轻肺动脉重构和右心指数。PAH模型动物的肺动脉NFAT3蛋白表达增高，沙格雷酯可下调NFAT3蛋白表达水平，表明5-HT2A受体可能参与了PAH时NFAT3上调的过程。沙格雷酯改善PAH的作用需要更多研究支持，NFAT也有可能成为新的治疗PAH的靶点。

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