模拟高原低氧对p53及其靶基因表达的调节*

王铭洋，赵 阳，张圣婷，陈学群，杜继曾

（浙江大学基础医学系神经生物学和生理学研究室，浙江杭州310058）

低氧是激活p53的重要因素之一，p53也是机体应对低氧应激的重要调节因子。作为转录因子，p53的主要功能是调节细胞周期停滞和细胞凋亡的相关靶基因，两类靶基因之间的表达平衡决定细胞命运，与细胞周期停滞相关的p53靶基因包括p21，cyclinB2，Fas／APO1等，与细胞凋亡相关的p53靶基因有bax，IGFBP3，Bcl-2等［1］。研究低氧应激下 p53及其靶基因的表达变化模式与规律，对理解机体的低氧适应性有重要意义。

小哺乳动物根田鼠（Microtus oeconomus）和高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是生活在我国青藏高原的优势物种，在长期进化中形成了对高原低氧环境的良好适应。目前没有文献报道高原鼢鼠和根田鼠肝脏p53的表达情况，我们实验室克隆了根田鼠（JX998171）和高原鼢鼠（JX998170）p53基因的编码区序列，本研究比较了两种高原动物p53表达情况；探讨了大鼠肝脏p53及其靶基因的表达模式。

1 材料与方法

1.1 动物和低氧处理

高原动物：成年健康的高原鼢鼠（体重250～300 g）和根田鼠（体重18～25 g）捕获于中国科学院海北高寒草甸生态系统实验站附近（37°39’N，101°19’E，海拔：3.352 km，气压：508 mmHg）。随机分为对照组和低氧组（n＝6），对照组置于海北实验站中（3.2 km），低氧组用含 8.0%O2和 92.0%N2的混合气体模拟7 km低氧6 h。

平原动物：采用健康雄性、清洁级SD大鼠，体重（170±20）g，购于浙江省医学科学院实验动物中心（SCXK2008-0033）。随机分为对照组和三个低氧组（n＝6）：低氧组分别模拟 2 km（16.0%O2），5 km（10.8%O2）和 7 km（8.0%O2）低氧8 h，对照组不给予低氧处理。

1.2 样品准备和方法

低氧处理后，动物被迅速断头牺牲，解剖获取肝脏后迅速置于液氮中冷冻，随后保存于-80℃。称取约50mg肝脏进行以下处理：（1）Q-PCR样品：使用东盛公司RNA提取试剂盒提取肝脏组织总RNA，并采用TransScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（TransGenBiotech，AT301）逆转录为 cDNA，置于-20℃保存。（2）Western-blot样品：将肝脏组织置于RIPA裂解液（碧云天，P0013B）中，并按 1∶100的比例加入 PMSF（碧云天，ST505）和 protease inhibitor cocktail（Biomol，BML-KI103-0001）蛋白酶抑制剂，充分匀浆后，4℃，10 000×g，30 min离心，取上清。用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，P0012）测定总蛋白浓度，并用上样缓冲液调整蛋白浓度至40μg总蛋白／20μl缓冲液。

1.3 Quantitative Real Time PCR

按说明书要求制备Q-PCR反应体系（SYBR®Premix Ex TaqTM，Takara），使用PRISM 7900HT实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）进行试验和分析。以18s rRNA作为内参基因。经预实验，PCR产物电泳条带清晰，无杂带，溶解曲线较好。

1.4 W estern blot检测

每个孔中加入20μl样品，进行SDS-PAGE（分离胶10%，浓缩胶5%）。按标准程序，转膜后用含5%的脱脂奶粉TBST封闭。加一抗（p53mousemAb，cell signaling）室温孵育2 h，一抗稀释倍数如下：高原鼢鼠样品1∶800，根田鼠样品1∶800（5%的脱脂奶粉的 TBS-T稀释），大鼠样品 1∶2 000（calbiochem，signalBoostTMimmunoreaction enhancer kit solution1）。用TBS-T漂洗，再加入二抗（山羊抗小鼠lgG），稀释倍数均为1∶2 000。室温孵育1 h后，用TBS-T漂洗。经ECL显影后，高原鼢鼠、根田鼠和大鼠p53蛋白条带单一，分子量正确。

1.5 统计学处理

数据用均数 ±标准误（¯x±Sx）表示，用 SPSS 15.0软件分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 低氧对高原鼢鼠、根田鼠和大鼠肝脏p53 mRNA表达的调节

低氧6 h（8.0%O2）显著减少高原鼢鼠肝脏p53mRNA表达（P＜0.05），而使根田鼠肝脏 p53 mRNA表达呈下降趋势（P＞0.05，图 1A）。低氧 8 h（16.0%O2）没有改变大鼠肝脏p53 mRNA表达，而严重低氧 8 h（10.8% 和 8.0%O2）显著增加大鼠肝脏 p53mRNA表达（P＜0.05，P＜0.01，图 1B）。

2.2 低氧对高原鼢鼠、根田鼠和大鼠肝脏p53蛋白表达的调节

低氧6 h（8.0%O2）显著减少高原鼢鼠和根田鼠肝脏的p53蛋白表达（P＜0.01，图 2A）；低氧 8 h（16.0%O2）没有改变 p53蛋白表达，而严重低氧8 h（10.8%和8.0%O2）显著增加 p53蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effects of hypoxia on hepatic p53mRNA expression in M.baileyi，M.oeconomus and rat，relative amountof p53mRNA evaluated by the ratio of p53 to 18s（±sx，n＝5，6）

Fig.2 Effects of hypoxia on heaptic p53 protein expression in M.baileyi，M.oeconomus and rat，relative amountof p53 protein evaluated by the ratio of band optical density（±sx，n＝5，6）

2.3 低氧对大鼠肝脏p53靶基因mRNA表达的调节

低氧8 h（16%O2）对大鼠肝脏凋亡靶基因bax和IGFBP3 mRNA表达没有影响；低氧8 h（10.8%O2）显著减少大鼠肝脏baxmRNA表达（P＜0.01），而IGFBP3mRNA表达呈下降趋势；低氧 8 h（8.0%O2）相对于 10.8%低氧 8 h显著减少 IGFBP3mRNA表达（P＜0.01），而 baxmRNA表达呈下降趋势（P＞0.05）；不同程度的低氧对Bcl-2 mRNA的表达均无显著影响（图 3A）；低氧 8 h（10.8%和 8.0%O2）显著增加 p21 mRNA表达（P＜0.01），但不同程度的低氧对大鼠肝脏cyclinB2 mRNA表达均无影响（图3 B）。

Fig.3 Effects of hypoxia on hepatic p53 downstream genesmRNA expression in rat，relative amountof p53 targetgenes evaluated by the ratio of p53 target genes toβ-actin（±sx，n＝6）IGFBP3：Insulin-like growth factor binding protein 3；Bcl-2：B-cell lymphoma 2

3 讨论

低氧通常被认为能够促进 p53表达，A.Sermeus和 C.Michiel提出p53的表达水平与低氧程度相关，常氧时保持低浓度，轻度低氧依旧保持低浓度甚至会更低，而中度低氧和重度低氧时浓度显著升高［2］。我们发现，低氧（8.0%O2）处理6 h后，高原动物根田鼠、高原鼢鼠肝脏中p53 mRNA和蛋白表达水平均显著下降，而低氧（8.0%O2）处理8 h后，大鼠p53mRNA和蛋白表达则显著上升。平原动物和高原动物的这种差异可能是不同的调节机制，Coose JP等发现1%低氧16 h可以增加MCF-7（人乳腺癌细胞）细胞p53蛋白表达，但使HepG2细胞 p53蛋白减少［3］，而 Pan Y等发现 HCT116（人结肠癌细胞）细胞在0.2%低氧过夜培养后，高浓度组（低氧处理前浓度为 3×105cells／60 mm）的细胞培养液 pH低于6.9，p53升高，低浓度组（低氧处理前浓度为 5×104cells／60 mm）细胞培养液pH不变，p53没有变化［4］。这些文献说明低氧是否诱导p53表达不仅与低氧程度，还与细胞类型、微环境均相关。根田鼠和高原鼢鼠长期生活在海拔3～5 km的高寒草甸，一方面，其低氧耐受性更强，面对一定程度的低氧，p53表达的下降可能对其生存是有利的，可能不易造成细胞凋亡；另一方面，低氧下重要的HIF-1α转录因子可能参与对p53的调节，Seok GL等发现HIF-1α的过表达可以抑制人p53蛋白的表达，我们实验室已经发现低氧（8.0%O2，6 h）可以显著增加高原鼢鼠HIF-1α蛋白的表达，而低氧也可以增加根田鼠HIF-1α蛋白［5］，所以高原动物p53表达的下降可能和低氧诱导的 HIF-1α升高相关。平原动物大鼠在低氧（8.0%O2）处理8 h后，肝脏p53基因和蛋白明显上调，Iswar Baitharu等发现7.6 km低氧7 d能显著增加大鼠大脑海马区p53蛋白的表达，国内也有文献报道间歇低氧（10%O2，8 h／d）能促进大鼠肺p53蛋白的表达。低氧时，平原动物大鼠p53的增加则有利于选择性激活或抑制p53下游的各类靶基因，保护正常细胞。

平原动物大鼠在低氧（10.8%和 8.0%O2）处理 8 h后，肝脏p53 mRNA和蛋白表达显著上升，但p53下游与细胞凋亡相关的靶基因bax和IGFBP3的表达均显著下降，而与细胞周期停滞相关的靶基因p21的表达则显著上升。有研究报道大鼠血清IGFBP3蛋白随着间歇低氧程度（6% ～8%O2，8 s／each，6～24 times／1 h）的增加而下降。低氧上调 p53细胞周期停滞靶基因，而下调p53细胞凋亡靶基因，反映机体适应低氧的一种策略，缺氧时机体正常代谢受阻，细胞损伤的威胁加剧，为避免细胞遭到损伤，节省能量消耗，激活细胞周期停滞靶基因可以保护正常细胞，而细胞凋亡靶基因的抑制也起到保护正常细胞的作用。

总之，低氧对高原动物和平原动物p53表达的影响是不同的，低氧下调高原动物p53基因和蛋白的表达，而上调平原动物p53基因和蛋白的表达；平原动物低氧后上调细胞周期停滞靶基因的表达，同时下调细胞凋亡靶基因的表达。以上结果，反映不同动物肝脏p53及其靶基因低氧反应性的不同，提示高原动物和平原动物肝细胞p53及其靶基因在低氧应激时具有不同的表达模式。

［1］ Zhao Y，Chen X Q，Du JZ.Cellular adaptation to hypoxia and p53 transcription regulation［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10（5）：404-410.

［2］ Sermeus A，Michiels C.Reciprocal influence of the p53 and the hypoxic pathways［J］.Cell Death Dis，2011，2：e164.

［3］ Cosse JP，Sermeus A，Vannuvel Ketal.Differential effects of hypoxia on etoposide-induced apoptosis according to the cancer cell lines［J］.Mol Cancer，2007，6：61.

［4］ Pan Y，Oprysko PR，Asham A Met al.p53 cannot be induced by hypoxia alone but responds to the hypoxicmicroenvironment［J］.Oncogene，2004，23（29）：4975-4983.

［5］ Chen X Q，Wang SJ，Du JZ.Diversities in hepatic HIF-1，IGF-I／IGFBP-1，LDH／ICD，and theirmRNA expressions induced by CoCl2in Qinghai-Tibetan plateau mammals and sea levelmice［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，292（1）：R516-526.