miRNAs对肠道健康的调控作用及机理

陶 新 徐子伟

(浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021)

miRNAs是一类长约18～26 nt的内源性单链非编码小分子RNA，作为细胞增殖、分化和凋亡的关键调控因子，影响着机体内部几乎所有的信号通路。它是体内最大的一类基因表达调控因子，可调控机体内超过1/3蛋白编码基因的表达，在动物的生长、发育和疾病发生发展过程中起着重要作用。miRNAs参与了干细胞的自我更新和多向分化[1]，与免疫、消化、神经、内分泌和心血管等系统的发育和疾病的发生发展有着密切关系。miRNAs的表达模式具有时序性和组织特异性，但大多数的miRNAs在相关物种间又高度保守，提示它们在关键细胞进程如应激适应能力和激素信号传导中起着重要作用[2]。目前有关miRNAs在肠道组织中的报道主要集中在其差异性表达与结直肠癌[3-5]、炎症性肠病(IBD)[6]、肠易激综合征(IBS)[7]和囊性纤维化(CF)[8]等肠道疾病的发生、发展及转归关系的研究。然而越来越多的研究结果表明，miRNAs的表达同样对肠道形态和结构的发育进程、正常维持以及肠道各种功能的发挥等起着重要调控作用。因此，全面而深入地了解miRNAs在肠道组织中的表达和调控机理，对于深层次挖掘和揭示影响机体肠道健康的分子机理具有非常重要的科学意义。

1 miRNAs在肠道组织中的表达

miRNAs在肠道组织中的种类和表达均较为丰富。其中，在人类肠道中的表达多来自对肠道成熟细胞系的研究结果。Cummins等[9]通过利用miRNA基因表达系列分析技术对结直肠癌细胞株HCT116、DLD1、RKO、Caco-2 和 SW480 等的研究，在人的结直肠细胞中共鉴定了200个成熟的已知 miRNAs和133个新发现的候选 miRNAs。随着miRNAs芯片及高通量测序技术的发展，使得不同动物肠道中越来越多的miRNAs被发现。在鼠上，McKenna等[10]通过高通量测序技术在小鼠空肠组织黏膜层检测到了1 094个成熟miRNAs序列，其中得到证实的miRNAs表达序列有545个，进一步分析结果表明，这些miRNAs分属540个miRNAs家族，并且涵盖了574个已知前体miRNAs(pre-miRNAs)中的339个。通过进一步比较小鼠空肠黏膜与肝、胰组织的miRNAs转录组，发现了65个在小肠黏膜特异性表达的miRNAs[11]。在 猪 上，Sharbati-Tehrani 等[12]首 先通过多联体克隆的方法在31日龄仔猪空肠和回肠组织鉴定了11种miRNAs，并进一步利用miR-Q方法验证了 miR-21、miR-24、miR-181a、miR-326、miR-423-3p、miR-484和miR-143在猪肠道组织中的表达 等 利用miRNA深度测序技术结合miRNAome芯片检测方法，研究了31日龄仔猪整个肠道组织(十二指肠、空肠、回肠和结肠)的miRNAs表达图谱，共发现332个miRNAs表达序列，其中201个miRNAs为在猪肠道中新发现的候选miRNAs。通过对miRNAs序列进行信号通路分析表明，它们可能在仔猪肠道各相关功能方面发挥了关键作用。此外，Coutinbo等[15]对30日龄胎牛小肠组织进行了miRNAs测序，共检测到了559个miRNAs序列，其中187个在小肠组织中呈特异性表达。

2 miRNAs对肠上皮细胞增殖、分化和凋亡的影响

肠道上皮细胞作为肠道上皮组织发挥消化、吸收、内外分泌等的主要功能细胞及构成免疫屏障的重要组成部分，其增殖、分化和凋亡的程度直接与肠道的健康密切相关，而miRNAs在一定程度上主宰了肠道上皮细胞的命运。在Dicer1酶基因(该基因编码了肠道上皮miRNAs生物合成的必需酶)缺失的小鼠体内，其肠上皮组织结构紊乱，空肠和结肠部位的杯状细胞数量降低，隐窝细胞凋亡显著增加，空肠段的细胞迁移率增加[10]。在斑马鱼胚胎上的研究发现，虽然miR-145在其肠道平滑肌中高度表达，但改变其表达的水平除了导致了斑马鱼肠道平滑肌功能的缺陷，还致使其上皮组织形态发育未成熟以及碱性磷酸酶表达缺失等肠道发育异常状态，进一步研究发现miR-145是通过其靶标转录因子 Gata家族中的gata6起作用的[16]。通过研究未分化细胞株Caco2-BBE和已分化细胞株HT29-Cl.19A的miRNAs表达差异，Dalmasso 等[17]认为 miRNAs在决定肠道上皮细胞的特有生理功能方面起了一定作用。Hino等[18]研究表明，参与动物肠道上皮组织细胞分化过程的miRNAs是通过具有种特异性的转录因子起作用的，且这些miRNAs能够以组织特异性的方式调控其靶基因的表达。Liao等[19]通过分离、培养小鼠的隐窝细胞，并利用类胰岛素生长因子-1(IGF-1)诱导细胞增殖24 h后，采用miRNA芯片技术检测到了多个miRNAs的差异表达，特别是miR-103的表达极显著下调。进一步通过荧光素酶和免疫印迹试验证实miR-103是通过作用于其靶基因，包括细胞周期蛋白E1(CCNE1)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)和环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白-1(CREB1)等参与了细胞周期G1/S的部分调控网络。此外，miR-16也通过抑制细胞周期G1/S的某些特定调控因子的表达影响了肠道上皮细胞的增殖[20]。

3 miRNAs与肠道黏膜免疫及抗炎作用

miRNAs同样也是肠道黏膜免疫的一类关键调控因子。在Dicer1酶灭活的小鼠结肠上皮组织的杯状细胞数量明显减少，且其特异性辅助性T细胞2(Th2)的影响因子抵抗素样分子家族β(RELMβ)也大量降低，从而导致小鼠肠道黏膜免疫力缺失，抗寄生虫感染能力下降。进一步研究表明，miRNAs通过调控杯状细胞的分化和促进Th2的抗寄生虫感染的免疫反应在肠道免疫中发挥作用[21]。研究还发现，miR-375在肠道上皮-免疫系统作用的发挥中是必不可少的[22]。Dkhil等[23]研究了球虫感染对Balb/c小鼠肠道miRNA表达图谱的影响，结果表明，口服乳突艾美耳球虫(E.papillata)4 d后，在小鼠空肠的634个miRNAs中发现 miR-1959、miR-21、miR-203和 miR-M23-1-5P 4个miRNAs的表达显著上调。进一步研究表明，大蒜提取物能够使球虫感染的小鼠空肠组织中上述前3个上调表达的miRNAs表达丰度相应回调，同时 miR-142-5P、miR-15A、miR-10A、miR-29B、miR-1902、miR-125A-5P、let-7E、miR-148A、miR-130A、miR-10B和 miR-93等miRNAs表达上调[24]。利用 Caco2-BBE细胞株进行研究证实，miR-92b、miR-7和miR-802均分别通过作用于其靶基因肠道肽转运蛋白(PepT1)、CD98和血管紧张素Ⅱ-Ⅰ型受体(AT1R)的 3'非翻译区域(UTR)，而最终在肠道抗炎作用中发挥了重要调控作用[25-27]。

4 miRNAs在维持肠道稳态中的作用

肠道组织的特征之一是富有与生物体共生的庞大微生物区系，动物一出生即有细菌定植，肠道上皮细胞可与高达1013的肠道菌群共生。然而，暴露于如此庞大的微生物群体，肠道上皮细胞是如何与其共生的呢?肠道稳态又是如何被维持的呢?研究证实，miRNAs的表达对于维持肠道稳态发挥了重要的调控作用。Chassin等[28]研究表明，在大量细菌定植后，肠道miR-146a的上调表达避免了细菌或者细菌内毒素脂多糖(LPS)对肠道黏膜的损伤，miR-146a主要通过翻译抑制和蛋白降解的方式作用于Toll样受体(TLR)信号分子白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK1)发挥了这种保护功能。但miR-146a的这种调控作用却不是肠道保持稳态唯一的机制，缺乏miR-146a表达的小鼠在出生后的前几周仍然是健康的[29]。与无菌小鼠相比，微生物的定植分别使小鼠的回肠和结肠组织的1个(miR-298)和8个miRNAs(miR-128、miR-200c* 、miR-342-5p、miR-465c-5p、miR-466d-3p、miR-466d-5p、miR-665、miR-683)异 常 表达[25]。Singh 等[30]在无菌和正常雄性小鼠的盲肠组织中检测到了334个miRNAs的表达，其中包括16个在无菌小鼠盲肠异常表达的miRNAs。上述研究证实，肠道内源微生物区系显著影响了肠道miRNAs的表达特征，提示miRNAs在共生菌调控肠道屏障和肠道稳态过程中起到了一定作用。

此外，有研究证实，肠道miRNAs还参与了肠道营养物质的吸收以及在抗应激方面发挥了调控作用。Liao等[31]利用载体构建、细胞转染、实时定量PCR及免疫印迹等技术研究表明，miR-584显著降低了Caco-2细胞和哺乳期小鼠小肠组织中的内源性乳铁蛋白受体蛋白的表达，提示miRNAs可能参与了新生动物营养代谢过程的调控。Yu等[32]研究了热应激对大鼠小肠组织中miRNAs和mRNAs表达图谱的影响。试验在对Sprague-Dawley雄性大鼠进行每日2 h，连续10 d的热应激处理后，通过组织形态学观察，发现热应激试验结束后3 d对小肠的空肠段损伤最严重。进一步利用mRNAs芯片检测发现热应激大鼠空肠组织中的270个基因上调和122个基因下调;miRNAs芯片检测发现了18个miRNAs上调和11个miRNAs下调。而且通过生物信息学分析表明，异常表达的mRNAs和miRNAs之间呈负相关。

5 小结

在畜禽养殖过程中，保障畜禽自身健康是进行动物生产的基本要素，而畜禽的健康状况则主要取决于其胃肠道的健康，特别是幼畜的肠道发育和成熟被认为是制约其快速生长的关键因素。因此，从长远角度来讲，彻底阐明影响畜禽肠道发育和成熟的分子机制对于促进畜禽生产具有极为重要的理论意义。而现有研究表明，miRNAs在动物肠道的发育、成熟和健康等多个方面发挥了重要的调控作用。因此，结合现有的各种研究手段和方法深入探讨miRNAs在幼畜的肠道发育和成熟过程中的作用，以及在各种应激或病原感染条件下，肠道组织中差异表达的特异性 miRNAs、miRNAs基因簇或miRNAs家族的协同作用及其靶基因的调控网络或信号通路，有望成为畜禽健康养殖基础研究的一个新热点。

[1]XU N，PAPAGIANNAKOPOULOS T，PAN G，et al.MicroRNA-145 regulates OCT4，SOX2，and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J].Cell，2009，137:647-658.

[2]LEUNG A K L，SHARP P A.MicroRNAs:a safeguard against turmoil?[J].Cell，2007，130:581-585.

[3]PIEPOLI A，TAVANO F，COPETTI M，et al.miRNA expression profiles identify drivers in colorectal and pancreatic cancers[J].PLoS One，2012，7:e33663.

[4]SARVER A L，FRENCH A J，BORRALHO P M，et al.Human colon cancer profiles show differential microRNA expression depending on mismatch repair status and are characteristic of undifferentiated proliferative states[J].BMC Cancer，2009，9:401.

[5]ZHANG B，WANG X K，WANG Y.Altered gene expression and miRNA expression associated with cancerous IEC-6 cell transformed by MNNG[J].Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2009，28:56.

[6]OLARU A V，SELARU F M，MORI Y，et al.Dynamic changes in the expression of microRNA-31 during inflammatory bowel disease-associated neoplastic transformation[J].Inflammatory Bowel Diseases，2011，17:221-231.

[7]ZHOU Q Q，SOUBA W W，CROCE C M，et al.MicroRNA-29a regulates intestinal membrane permeability in patients with irritable bowel syndrome[J].Gut，2010，59:775-784.

[8]BAZETT M，PAUN A，HASTON C K.MicroRNA profiling of cystic fibrosis intestinal disease in mice[J].Molecular Genetics and Metabolism，2011，103:38-43.

[9]CUMMINS J M，HE Y P，LEARY R J，et al.The colorectal microRNAome[J].Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of A-merica，2006，103:3687-3692.

[10]MCKENNA L B，SCHUG J，VOUREKAS A，et al.MicroRNAs control intestinal epithelial differentiation，architecture，and barrier function[J].Gastroenterology，2010，139:1654-1664.

[11]GAO Y，SCHUG J，MCKENNA L B，et al.Tissuespecific regulation of mouse microRNA genes in endoderm-derived tissues[J].Nucleic Acids Research，2011，39:454-463.

[12]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，SCHOLVEN J，et al.Concatameric cloning of porcine microRNA molecules after assembly PCR[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，375:484-489.

[13]SHARBATI-TEHRANIS， KUTZ-LOHROFF B，BERGBAUER R，et al.miR-Q:a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample[J].BMC Molecular Biology，2008，9:34.

[14]SHARBATI S，FRIEDLÄNDER M R，SHARBATI L，et al.Deciphering the porcine intestinal microRNA transcriptome[J].BMC Genomics，2010，11:275.

[15]COUTINBO L L，MATUKUMALLI L K，SONSTEGARD T S，et al.Discovery and profiling of bovine microRNAs from immune-related and embryonic tissues[J].Physiological Genomics，2007，29:35-43.

[16]ZENG L，CARTER A D，CHILDS S J.miR-145 directs intestinal maturation in zebrafish[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106:17793-17798.

[17]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.MicroRNAs determine human intestinal epithelial cell fate[J].Differentiation，2010，80:147-154.

[18]HINO K，TSUCHIYA K，FUKAO T，et al.Inducible expression of microRNA-194 is regulated by HNF-1α during intestinal epithelial cell differentiation[J].RNA，2008，14:1433-1442.

[19]LIAO Y L，LÖNNERDAL B.Global microRNA characterization reveals that miR-103 is involved in IGF-1 stimulated mouse intestinal cell proliferation[J].PLoS One，2010，5:e12976.

[20]BALAKRISHNAN A，STEARNS A T，PARK P J，et al.MicroRNA miR-16 is anti-proliferative in enterocytes and exhibits diurnal rhythmicity in intestinal crypts[J].Experimental Cell Research，2010，316:3512-3521.

[21]GOTO Y，KIYONO H.Epithelial cell microRNAs in gut immunity[J].Nature Immunology，2011，12:195-197.

[22]BITON M，LEVIN A，SLYPER M，et al.Epithelial microRNAs regulate gut mucosal immunity via epithelium-T cell crosstalk[J].Nature Immunology，2011，12:239-246.

[23]DKHIL M，ABDEL-BAKI A A，DELI C'D，et al.Eimeria papillata:upregulation of specific miRNA-species in the mouse jejunum[J].Experimental Parasitoligy，2011，127:581-586.

[24]AL-QURAISHY S，DELIC D，SIES H，et al.Differential miRNA expression in the mouse jejunum during garlic treatment of Eimeria papillata infections[J].Parasitology Research，2011，109:387-394.

[25]DALMASSO G，NGUYEN H T T，YAN Y T，et al.Microbiota modulate host gene expression via microRNAs[J].PLoS One，2011，6:e19293.

[26]NGUYEN H T T，DALMASSO G，YAN Y T，et al.MicroRNA-7 modulates CD98 expression during intestinal epithelial cell differentiation[J].The Journal of Biological Chemistry，2010，285:1479-1489.

[27]SANSOM S E，NUOVO G J，MARTIN M M，et al.miR-802 regulates human angiotensinⅡtype 1 receptor expression in intestinal epithelial C2BBe1 cells[J].American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2010，299:G632-G642.

[28]CHASSIN C，KOCUR M，POTT J，et al.miR-146a mediates protective innate immune tolerance in the neonate intestine[J].Cell Host ＆ Microbe，2010，8:358-368.

[29]LU L F，BOLDIN M P，CHAUDHRY A，et al.Function of miR-146a in controlling treg cell-mediated regulation of Th1 responses[J].Cell，2010，142:914-929.

[30]SINGH N，SHIRDEL E A，WALDRON L，et al.The murine caecal microRNA signature depends on the presence of the endogenous microbiota[J].International Journal of Biological Sciences，2012，8:173-186.

[31]LIAO Y，LÖNNERDAL B.miR-584 mediates posttranscriptional expression of lactoferrin receptor in Caco-2 cells and in mouse small intestine during the perinatal period[J].The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2010，42:1363-1369.

[32]YU J，LIU F L，YIN P，et al.Integrating miRNA and mRNA expression profiles in response to heat stress-induced injury in rat small intestine[J].Functional ＆ Integrative Genomics，2011，11:203-213.