甲型流感病毒PB1-F2蛋白功能的研究进展

资海荣，李伟，李婕，周丹，卫平民

(东南大学公共卫生学院，江苏南京 210091)

流感病毒(influenza virus)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，根据病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的基因特征，分为甲(A)型、乙(B)型和丙(C)3型。其中，甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)在自然界中分布广泛，可以感染多种禽类和哺乳动物，并在人群中不断传播而引发世界大流行［1］。

甲型流感病毒为单股负链RNA病毒，其基因组包括8 个独立的片段，即 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS，其中，2001年 Chen等在对 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的研究中发现了一种不属于流感病毒任何已知开放阅读框(open reading frame，ORF)编码的多肽，即PB1-F2［2］。该蛋白是导致甲型流感病毒致病性的关键蛋白之一，在1968、1957和1918年的3次流感大流行的流感病毒中均发现了这种蛋白。Gibbs等［3］研究发现，PB1-F2可以诱导细胞凋亡和调节宿主细胞的免疫反应。此外，PB1-F2在某些流感病毒感染宿主过程中具有增强病毒聚合酶活性以及特异的抗原表位，通过加剧宿主的炎症反应，提高病毒毒力［4-5］。

1 PB1-F2蛋白的结构特征

Bruns等［6］研究发现，sPB1-F2受分别位于氨基末端和羧基末端的两个结构域的寡聚蛋白调节。PB1-F2蛋白结构的稳定性取决于溶剂的疏水性，其羧基末端不是一个完全两性的分子，而是一个带正电的、含有PB1-F2线粒体靶向序列的α螺旋结构，分子螺旋结构会随着溶液的亲水性增加而逐渐消失。研究者利用H-NMR光谱分析方法证明，羧基末端具有很强的α-螺旋的性质，氨基酸残基位于Ile(55)到Lys(85)之间，并由不规则卷曲过渡到较弱的α-螺旋，氨基末端位于Trp(9)到Lys(20)之间。PB1-F2所具有的寡聚性以及α螺旋形的结构可以用由sPB1-F2与线粒体膜进行交互作用加以模拟［6-7］。Gibbs等［3］在 Hela 细胞中PB1-F2-EGFP融合蛋白的表达研究中发现了PR8的PB1-F2的羧基端的一段氨基酸序列，预测并证实这段序列可形成带正电荷的两亲性α-螺旋。而带有正电荷的两亲性螺旋结构一般被认为是帮助蛋白定位到线粒体的结构［8］，也被认为是PB1-F2定位在线粒体内膜的必需结构。此外，研究者通过一系列实验发现，PB1-F2蛋白氨基端46～75位氨基酸残基是PB1-F2定位在线粒体所必需的肽段。进一步研究发现，氨基酸残基63～75位和第73位赖氨酸(Lys)、第75位精氨酸(Arg)是PB1-F2蛋白的MTS定位于线粒体所必需的。在细胞中，PB1-F2的表达可以引起线粒体的分布和形态改变，导致线粒体跨膜电势去极化，使线粒体失去膜电位。不同的流感病毒毒株的PB1-F2蛋白在病毒感染过程中因序列变化和线粒体定位的差异，其功能也有所不同。

Zell等［9］通过分析来自GenBank的甲型流感病毒1 864个样本的PB1-F2基因序列发现，编码PB1-F2蛋白基因片段的同义突变与非同义突变的置换率高于编码PB1蛋白的基因片段，并由此推断，由于PB1-F2蛋白的表达，使甲型流感病毒的致病性增强，变异性亦增强。1918年西班牙流感野生型流感株是最早发现的含有至少87个氨基酸的完整型PB1-F2，1956年发现了第57位氨基酸残基终止的断裂型PB1-F2，2009年首次发现了含有12个氨基酸残基的断裂型PB1-F2［10］。Zell等［9］研究发现，除 H5N2、H6N6、H9N2、H13N2之外，大多数禽流感病毒编码完整型的PB1-F2，不同的宿主、不同的亚型病毒株的PB1-F2长度存在差异，而不同长度的PB1-F2的甲型流感病毒株的基因序列在宿主细胞中的定位以及在宿主细胞中的分子功能亦存在差异［5］。因此，PB1-F2蛋白存在不同长度、不同氨基酸序列、不同的分子定位、不同的功能，表现为毒株特异性致病性。

2 PB1-F2蛋白的功能

2.1 PB1-F2蛋白诱导细胞凋亡

Zamarin等［11］通过用M30阻抗剂(切冬酶裂解细胞角蛋白)处理转染了PB1-F2的293T细胞，发现转染细胞易于被肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)诱导凋亡;他们同时设立对照组并发现在无任何促凋亡因子存在的情况下，细胞发生了凋亡的现象，结果表明PB1-F2蛋白具有诱导细胞凋亡的作用，结论与用敲除PB1-F2的突变病毒感染小鼠的实验数据［11］相一致。同时，研究还表明PB1-F2的诱导细胞凋亡作用是可以被Bcl-xl所阻抗。PB1-F2蛋白诱导细胞凋亡作用是通过破坏细胞线粒体结构并使线粒体内膜形成凋亡孔，导致宿主细胞通透性的改变从而促进细胞色素C的释放而发挥作用，诱导线粒体促细胞凋亡因子tBid的促细胞凋亡的作用。然而，Bcl-xl的过度表达则不能抑制PB1-F2蛋白对线粒体破坏作用。进一步研究发现，PB1-F2蛋白发生诱导凋亡的作用主要是通过线粒体内膜ANT3通道和线粒体外膜VDAC1通道发挥的，并且ANT3通道主要是通过与蛋白羧基端发生交互作用，而VDAC1通道与蛋白的羧基端与氨基端均可发生交互作用从而导致细胞的凋亡。同时，Zamarin等在使用ANT3阻抗剂使得线粒体内膜ANT3不能发挥作用的情况下，未发现凋亡现象，从而验证线粒体内膜ANT3通道。然而，由于到目前为止未发现VDAC1通道阻抗剂，因此无法验证VDAC1通道在促凋亡过程中的作用。根据一系列的研究分析推测，PB1-F2促凋亡作用的机制有三:第一，通过线粒体内膜ANT3通道和线粒体外膜VDAC1通道，PB1-F2蛋白仅仅是这两个通道的中间桥梁，起增强作用;第二，PB1-F2蛋白通过作用于线粒体的细胞内膜与线粒体外膜，对ANT3和VDAC1通道起到链接的作用;第三，PB1-F2蛋白同时作用于线粒体的细胞内膜与线粒体外膜，直接导致细胞通透性的改变从而促使细胞的凋亡。最近的研究［13］结果表明，PB1-F2蛋白与Bcl-2家族促细胞凋亡因子的功能类似。

PB1-F2蛋白的促细胞凋亡作用是建立在PB1-F2蛋白含有线粒体靶向序列(MTS)的基础上，而含有MTS的PB1-F2至少含有87个氨基酸［3］，因此，促细胞凋亡的功能只局限于含有87个以上氨基酸的PB1-F2毒株。而且PB1-F2的促细胞凋亡是促进宿主的免疫细胞的凋亡，而并非上皮细胞［2］。

此外，对于PB1-F2对线粒体功能的研究一般都是局限于体外研究，PB1-F2在人体内流感病毒感染人体时所发挥的作用仍然有待进一步的探讨。

2.2 PB1-F2蛋白增强病毒聚合酶活性

聚合酶复合物由病毒蛋白PB2、PB1和PA组成，是决定病毒RNA合成过程的重要因子之一［14］。病毒聚合酶复合物与流感病毒NP蛋白组成核糖核蛋白复合体(vRNP)，其中NP主要功能是促进其包裹的RNA片段被聚合酶复合物识别。

Mazur等［15］利用 PR8感染人肺腺癌上皮细胞A549，发现在病毒复制的初期阶段PB1-F2蛋白的表达水平与病毒NP以及PB1相当，但经过几个复制周期之后，PB1-F2蛋白表达水平明显下降，与此同时，在细胞质及细胞核中均发现PB1-F2蛋白的表达。由此得到结论:PB1-F2蛋白具有的功能不仅限于定位在线粒体诱导细胞凋亡，它还具有其他的功能。利用敲除PB1-F2的PR8病毒和PR8野生株分别感染MDCK细胞作空斑滴定实验，结果显示，敲除PB1-F2的PR8病毒形成的空斑直径明显小于PR8野生株在MDCK细胞上形成的空斑直径。一般认为空斑滴定实验是与聚合酶活性有着很大的关系［16］。Mazur等在进一步的实验中发现，在敲除PB1-F2的情况下，流感病毒的聚合酶活性显著降低，意味着PB1-F2可能在病毒基因组的转录水平上发挥重要作用。

此外，有学者［17］还发现，部分PB1-F2可以与流感病毒蛋白PB1结合，但并不结合其他聚合酶成分如NP或PB2蛋白。实验表明，在敲除PB1-F2蛋白的情况下，流感病毒蛋白PB1的定位发生改变，主要定位在细胞质中。由此推测，PB1-F2可以通过结合PB1的方式将部分PB1滞留在细胞核中，其作用可能是通过阻止PB1过早地由细胞核中转移到细胞质中，以此来延长聚合酶在细胞核中的时间，达到保证聚合酶活性的目的［16］。通过反向遗传学和基因重排的方法可获得表达全长PB1-F2的甲流病毒，并与其他一系列含有PB1-F2的毒株比较，系统分析PB1-F2的表达对病毒聚合酶活性的影响，研究包括PB1的合成和在细胞内的定位以及病毒在小鼠体内复制中的差异。结果显示，PB1-F2蛋白的表达对聚合酶活性、PB1的合成和病毒复制的影响主要是依赖于感染宿主细胞的种类和毒株的种类。然而，在季节性流感病毒H3N2毒株中，通过敲除PB1-F2突变重组改变H3N2毒株的阅读框架，结果发现敲除PB1-F2蛋白的H3N2病毒在感染宿主过程中，PB1的合成及聚合酶的活性均未发生显著变化。研究表明PB1-F2对聚合酶的影响并不是其普遍的功能，仅与特定的毒株相关。在其他毒株上敲除PB1-F2或者在1918年或1957年大流行的H1N1病毒中表达全长PB1-F2蛋白，均对甲流病毒在小鼠肺部的复制没有影响。因此，推测PB1-F2还可通过其他途径影响病毒感染过程，提高流感病毒在哺乳类宿主中的毒力［18］。

近来研究［19］也发现，PB1-F2蛋白通过结合PB1蛋白调控病毒RNA(vRNA)聚合酶活性。同时进一步证明，PB1-F2蛋白可以增加PB1的蛋白表达水平和宿主细胞中vRNA的表达水平。此外，更多的vRNA表达会引起其他病毒蛋白NP、Ml和NS1的表达增加。将PB1-F2蛋白的氨基端(1～50位)和羧基端(51～87位)分别在MDCK细胞中表达，然后感染敲除PB1-F2的PR8突变病毒，结果显示PB1-F2的氨基端可以增加PB1的蛋白表达水平，而羧基端则没有表现出该功能。因此，PB1-F2的氨基端对病毒的复制可能起着重要的正调控作用。此外，Mitzner等［19］在研究中发现，在感染宿主细胞过程中，无论是PR8流感毒株PB1-F2，还是在体外合成的PB1-F2片段均可被纯化的蛋白激酶(PKC)或细胞裂解物所磷酸化。通过酵母双杂交实验以及DNA突变分析发现，PKCα与PB1-F2存在相互结合作用。PKC抑制剂预处理的细胞中PB1-F2的磷酸化被减弱，而PKC激活剂PMA预处理的细胞中PB1-F2的磷酸化有所增强。通过电喷雾质谱发现，PB1-F2的35位丝氨酸(Ser-35)、27位苏氨酸(Thr-27)均是PKC重要磷酸化位点，前者是最主要的磷酸化位点。如果把PB1-F2的27位和35位磷酸化位点突变，重组的PR8病毒的PB1-F2不再发生磷酸化，且感染过程中caspase-3的激活减弱，病毒的复制能力减弱，研究表明PB1-F2被识别的完整的磷酸化位点对PB1-F2在病毒复制过程中发挥功能起着重要作用［19］。

2.3 PB1-F2蛋白抗原性

Andreansky等［20］对H1N1和H3N2流感病毒进行反向遗传学研究，首先通过给予雌性B6小鼠腹腔注射甲型流感H1N1病毒的-NP-PA，然后改为通过鼻腔途径给予甲型流感H3N2病毒的-NP-PA，结果发现在小鼠的脾脏存在大量的 CD8+KbPB1703+、CD8+KbNS2114+和CD8+DbPB1-F262+，支气管肺泡中存在大量炎症细胞。然而，当将初免-加强免疫的处理顺序反过来，结果发现与之前的效应并不相一致。将被病毒所感染的细胞作为探针，用固相酶联免疫斑点技术分析所有的反应，二次免疫应答所引起的免疫细胞大量地克隆增殖，研究表明初免-加强免疫策略暴露于含有-NP-NA的病毒所引起总的效应量不同于暴露于未加处理的病毒感染所引起的效应量。初免也得到同样的结果。实验表明，完整的PB1-F2蛋白上存在特异的抗原表位，能诱导宿主体内免疫T细胞的表达。实验还显示，小鼠感染表达完整PB1-F2的流感毒株后，小鼠脾脏和呼吸道中CD8 DbPB1-F262+T细胞高度表达，而这些发现将对自然感染和疫苗的研制有着重要的启示。

Andreansky等还通过实验推测，抗原浓度、抗原的活性、T细胞抗原受体限制谱、T细胞抗原受体活性可能影响二次免疫应答产生抗体的量，因此，可以通过研究对这些因素影响的大小，开发基于CD8T的细胞肽疫苗以对抗病毒的感染以及致瘤的过程。然而对于PB1-F2蛋白抗原性的研究相对较少，有待更进一步的研究。

2.4 PB1-F2促进炎症反应

Peltola等［21］让幼年雪豹首先感染不同型别的流感病毒，然后感染肺炎链球菌，结果发现十分之九的感染H3N2流感病毒的幼雪豹发生了鼻窦炎或中耳炎，只有十一分之一的幼雪豹在感染H1N1或B型流感之后发生了鼻窦炎或中耳炎。研究结果表明，不同型别的流感病毒所引起的肺炎链球菌感染存在差异，由此推测流感病毒不同的亚型之间毒力因子存在差异。

PB1-F2蛋白作为新近被发现的流感病毒重要的毒力因子，对甲型流感病毒导致疾病发生起着重要的作用。PB1-F2蛋白在1918年甲流大流行时起到重要作用，研究［21］表明感染了甲型流感病毒的大鼠肺部出现了严重的病理学改变和致命的肺炎球菌感染。有记录以来发生的最严重的人流感大流行是在1918年至1919年，这次的大流行导致了全球5 000万人死亡［16］，其中绝大多数患者的死亡原因都被认为是二次细菌性肺炎。二次细菌性肺炎在以往均被认为是由病毒感染所引起的，而Sethi等［22］的研究结果表明，二次细菌性肺炎是在甲型流感病毒的发生之后出现的，主要病原体是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌。进一步研究发现，PB1-F2蛋白是导致肺部二次感染的重要致病因子［23-24］。而PB1-F2蛋白致病性增强的主要原因是破坏肺泡巨噬细胞［23］。

研究者利用PB1-F2蛋白断裂型的毒株与PB1-F2蛋白完整型的病毒分别感染小鼠，与感染断裂型PB1-F2蛋白的PR8菌株的小鼠相比，感染完整型PB1-F2蛋白的小鼠肺部出现了由肺炎链球菌导致的损坏和大量的细胞因子聚集。这种差异表现为受病毒感染后的第7天，在小鼠支气管肺泡灌洗液中发现有大量中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞增加。研究表明并非所有的含PB1-F2蛋白菌株的甲型流感病毒都会引起二次细菌感染导致的肺损伤。实验过程中PB1-F2蛋白可引起宿主血液炎症细胞增加、血清细胞因子升高和肺组织细菌量的增加［25］。正常情况下呼吸道上皮细胞产生黏液，并清除入侵的病原体和颗粒物质。病毒感染后PB1-F2蛋白破坏了呼吸道上皮细胞，使其纤毛和产生的黏液减少，清除功能严重受损，细菌在肺中的停留时间增加，增加了肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌等的继发感染机会，致使宿主死亡率升高。进一步研究发现，PB1-F2蛋白中特定的氨基酸对病毒致病性的增加有着关键性作用。通过鼻腔途径让小鼠感染保留羧基端的PB1-F2蛋白的病毒株，小鼠肺中出现类似感染PR8野生型流感菌株的表现，存在大量的巨噬细胞和嗜中粒细胞。而保留氨基端的PB1-F2蛋白却未发现该现象。结果表明，PB1-F2蛋白主要通过羧基端作用使免疫细胞聚集在肺内，导致二次细菌性感染引起肺损伤。然而，到目前为止，尚无关于1918年的流感大流行的毒株所引起肺部巨噬细胞和嗜中粒细胞增加以及疾病发生的分子学机制的研究。

此外，最近研究［26］发现，在香港(1997 年，H5N1)和Brevig Mission(1918年，H1N1)流感毒株中PB1-F2的第66位碱基发生点突变，产生氨基酸N66S，并证实其具可提升流感病毒的致病性。进一步研究发现，N66S可能主要是通过延迟先天性免疫反应，抑制早期干扰素的作用，使病毒快速增长，并最终导致严重肺部免疫以及病理改变。而N66S对断裂型及完整型PB1-F2蛋白流感毒株功能的影响有待进一步研究。

3 结 语

甲型流感病毒引起流感大流行的潜在威胁引起了广泛关注，大量的研究表明PB1-F2蛋白为甲型流感病毒致病的重要毒力因子，PB1-F2蛋白与甲型流感病毒作用于不同宿主所产生的致病性强弱是否存在着必然联系，以及PB1-F2蛋白影响流感病毒致病性的作用分子机制还需要更进一步的研究，为当前可能发生的人流感大流行提供应对思路。

［1］李亮，嵇红，张伟伟，等.甲型H1N1流感流行病学及应对策略研究进展［J］.现代医学，2010，38(1):77-81.

［2］CHEN W，CALVO P A，MALIDE D，et al.A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death［J］.Natural Med，2001，7:1306-1312.

［3］GIBBS J，MALIDE D，HORNUNG F，et al.The influenza A virus PB1-F2 protein targets the inner mitochondrial membrane via a predicted basic amphipathic helix that disrupts mitochondrial function ［J］.J Virol，2003，77:7214-7224.

［4］COLEMAN J R.The PB1-F2 protein of influenza A virus:increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages［J］.Virol J，2007，4:9.

［5］CHEN C J，CHEN G W，WANG C H，et al.Differential localization and function of PB1-F2 derived from different strains of influenza A virus［J］.J Virol，2010，84:10051-10062.

［6］BRUNS K，STUDTRUCKER N，SHARMA A，et al.Structural characterization and oligomerization of PB1-F2，a proapoptotic influenza A virus protein［J］.J Biol Chem，2007，282(1):353-363.

［7］HENKLEIN P，BRUNS K，NIMTZ M，et al.Influenza A virus protein PB1-F2:synthesis and characterization of the biologically active full length protein and related peptides［J］.J Pept Sci，2005，11(8):481-490.

［8］ENDO T，KOHDA D.Functions of outer membrane receptors in mitochondrial protein import［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1592(1):3-14.

［9］ZELL R，KRUMBHOLZ A，WUTZLER P，et al.Influenza A virus PB1-F2 gene［J］.Emerg Infect Dis，2006，12(10):1607-1608.

［10］CHEN G W，YANG C C，TSAO K C，et al.Influenza A virus PB1-F2 gene in recent Taiwanese isolates［J］.Emerg Infect Dis，2004，10:630-636.

［11］ZAMARIN D，GARCIA-SASTRE A，XIAO X，et al.Influenza virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1［J］.PLoS Pathog，2005，1(1):e4

［12］YAMADA H，CHOUNAN R，HIGASHI Y，et al.Mitochondrial targeting sequence of the influenza A virus PB1-F2 protein and its function in mitochondria［J］.FEBS Lett，2004，578(3):331-336.

［13］Henklein P，Bruns K，Nimtz M，et al，Influenza A virus protein PB1-F2:Synthesis and characterization of the biologically active full length protein and related peptides［J］.J Pept Sci，2005，11(8):481-490.

［14］李雪.HAX-1通过与禽流感病毒非结构蛋白PB1-F2相互作用影响细胞凋亡和病毒复制［D］.南京:南京大学，2012.

［15］MAZUR I，ANHLAN D，MITZNER D，et al.The proapoptotic influenza A virus protein PB1-F2 regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein［J］.Cell Microbiol，2008，10(5):1140-1152.

［16］CONENELLO G M，PALESE P.Influenza A virus PB1-F2:A small protein with a big punch［J］.Cell Host Microbe，2007，2(4):208-209.

［17］GABRIEL G，DAUBER B，WOLFF T，et al.The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:18590-18595.

［18］McAULEY J L，HORNUNG F，BOYD K L，et al.Expression of the 1918 influenza A virus PB1-F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia［J］.Cell Host Microbe，2007，2(4):240-249.

［19］MITZNER D，DUDEK S E，STUDTRUCKER N，et al.Phosphorylation of the influenza A virus protein PB1-F2 by PKC is crucial for apoptosis promoting functions in monocytes［J］.Cell Microbiol，2009，11:1502-1516.

［20］ANDREANSKY S S，STAMBAS J，THOMAS P G，et al.Consequences of immunodominant epitope deletion for minor influenza virus-specific CD8+-T-Cell responses［J］.J Virol，2005，79(7):4329-4339.

［21］PELTOLA V T，BOYD K L，MCAULEY J L，et al.Bacterial sinusitis and otitis media following influenza virus infection in ferrets［J］.Infect Immune，2006，74(5):2562-2567.

［22］SETHI S.Bacterial pneumonia.Managing a deadly complication of influenza in older adults with comorbid disease［J］.Geriatrics，2002，57(3):56-61.

［23］COLEMAN J R.The PB1-F2 protein of influenza A virus:increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages［J］.Virol J，2007，4:9.

［24］McAULEY J L，ZHANG K，MCCULLERS J A.The effects of influenza A virus PB1-F2 protein on polymerase activity are strain specific and do not impact pathogenesis［J］.J Virol，2010，84(1):558-564.

［25］王清艳，王靖飞.A型流感病毒PB1-F2蛋白的结构与功能研究进展［J］.动物医学进展，2007，28(11):82-84.

［26］CONENELLO G M，TISONCIK J R，ROSENZWEIG E，et al.A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza a virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo［J］.J Virol，2011，85(2):652-662.