常用实验动物鼻上皮毒性病理学研究简介

杨艳伟，吕建军，张 頔，霍桂桃，林 志，屈 哲，苗玉发，潘东升，范玉明，王秀文，王 雪，汪巨峰，李 波 （中国食品药品检定研究院，北京 100050）

鼻腔吸入途径给药具有许多其它给药途径无法比拟的优越性。例如：①鼻腔粘膜生物酶的活性比胃肠道低，能够降低对如多肽、激素、疫苗等药物的降解；②避免了口服药物的肝脏首过效应，也避免了药物对肝脏的损害；③鼻腔粘膜血流丰富，上皮透过性良好，鼻腔给药平均生物利用度较高；④免疫应答效率高，能有效诱导粘膜局部的中和抗体产生，促进B/T淋巴细胞分泌细胞因子参与免疫调节过程，且所需的抗原量更低；⑤经鼻给药可使药物绕过血脑屏障直接到达中枢神经系统；⑥使用方便，不良反应较小，有较好的依从性。因此，鼻腔给药制剂发展迅速，已成为当前研究的热点之一。

鼻的结构和功能复杂，不同种属实验动物间大体和显微解剖学差别显著，识别、记录及解释鼻病变是毒理学实验的一个难题。鼻病变的识别需要细致的生前症状观察、大体剖检以及组织病理学检查。组织病理学检查有赖于高质量和一致性良好的组织切片，并熟悉吸入实验常用动物的鼻解剖与组织结构以及其生理与生化知识，了解老年性、背景性和药物毒性相关病变的特点等[1]。本文主要对常见实验动物鼻腔的大体解剖学与组织学及其种属差异、常用实验动物组织病理学检查鼻腔上皮的取材方法、吸入药物引起的鼻上皮损伤的特点、使用吸入药物的动物数据来评估人类风险进行综述，还简要介绍了非吸入途径给药引起的啮齿类动物鼻病变组织病理学特点和机制，为吸入途径给药及非吸入途径药物临床前安全性评价毒性病理学研究提供参考。

1 常用实验动物鼻解剖学与组织学及其种属差异

1.1 鼻大体解剖学与组织学及其种属差异

鼻气道被鼻中隔分为两个通道，每个通道从鼻孔延伸到喉，吸入的空气经过鼻孔进入前庭，前庭主要由软骨围绕，表面被覆鳞状上皮。人类与实验室动物不同，鼻前庭仅鼻孔处长有数量不等的鼻毛。吸入空气通过鼻前庭后，再通过整个呼吸道最狭窄的部分—鼻腔阀 （内口）进入到固有鼻腔，内衬血管和神经支配的粘膜，粘膜表面覆盖连续的粘液。鼻甲从侧壁突入固有鼻腔，鼻甲可增加鼻的内表面积，对吸入空气有过滤、温暖和湿润作用[2]。

尽管大多数哺乳动物的鼻气道结构大体相似，但鼻结构有显著的种属差异。人的鼻结构相对简单，呼吸是主要功能 （嗅觉不敏锐），其它哺乳动物的鼻结构复杂，嗅觉作为主要功能 （嗅觉敏锐）。而且，人类及一些非人灵长类的鼻和口腔结构允许鼻腔和口腔呼吸，用于吸入毒性实验的大多数啮齿类，例如大鼠、小鼠、仓鼠及豚鼠只进行鼻腔呼吸。除了鼻腔的大小和体积明显不同外，由于鼻甲结构的大小和复杂性导致鼻腔的表面积及气流模式也有显著差异，大鼠、兔和犬与人和猴相比更复杂，人和猴的鼻甲结构相似程度较高，但是，人有3个鼻甲，猴只有2个鼻甲[2－3]。

1.2 鼻粘膜

鼻气道表面被覆粘膜分两层：上皮细胞层和固有层，固有层含有不同种类和数量的血管和淋巴管、神经、腺体和间质细胞 （成纤维细胞、淋巴细胞及肥大细胞）。被覆鼻气道的表面上皮细胞的分布和细胞类型也有种属差异，大多数动物鼻表面上皮细胞含有5种类型上皮细胞：①嗅上皮：分布于鼻腔背侧或后背侧；②鳞状上皮：主要分布于鼻前庭；③移行上皮，即无纤毛立方/柱状上皮：分布于固有鼻腔的近端或前端，位于鳞状上皮和呼吸上皮之间；④呼吸上皮，也叫假复层纤毛立方/柱状上皮：分布于固有鼻腔和鼻咽部；⑤淋巴上皮：覆盖鼻相关淋巴样组织 （nasal－associated lymphoid tissue，NALT）。

1.2.1嗅上皮

鼻上皮主要种属差异是鼻气道被覆嗅上皮百分比不同，啮齿类与猴或人相比，嗅上皮所占鼻气道百分比明显更多。F344大鼠约50%鼻腔表面衬覆嗅上皮，而人仅3% 鼻腔表面衬覆嗅上皮，小鼠、兔和犬的鼻腔嗅上皮所占百分比与大鼠很接近。嗅上皮主要由3种上皮细胞组成，即嗅觉感觉神经元（the olfactory sensory neuron，OSN）、支持细胞和基底细胞。嗅上皮还有少量的微绒毛细胞和鲍曼氏腺。

1.2.1.1嗅觉感觉神经元 （OSN）

OSN是镶嵌在支持细胞之间的双极神经元[4]，树突状部分向上延伸到上皮表面，末端膨大呈球形嗅泡，嗅泡表面伸出平均10～15根不游动的纤毛。这些纤毛约50微米长，直径在0.1～0.3微米，互相交织，表面微绒毛可使接触气味物质的表面积明显增大。OSN的轴突由细胞底部伸出穿过基底层，与其它OSN的轴突在固有层中集合形成无髓鞘的神经束，即嗅神经，嗅神经穿过颅骨筛板，形成嗅球的外层嗅神经。OSN的轴突与嗅球内的僧帽细胞和簇绒细胞的树突形成约2000个突触小球，嗅觉信息进一步通过僧帽细胞和簇绒细胞的轴突传送到嗅皮层[5]。因为嗅上皮与环境直接接触，吸入外源性物质如空气中的化学药物或微生物，可能会引起嗅觉神经元的细胞损伤和死亡。与其它神经元不同，嗅觉神经元可再生以维持其嗅觉功能，原因是嗅上皮基底细胞层祖细胞的不断增殖和分化为成熟嗅觉神经元[6]。

1.2.1.2支持细胞

支持细胞是柱状上皮细胞，跨越嗅上皮全层，椭圆形胞核位于嗅上皮顶部排列成单行，支持细胞表面大量的微绒毛，与OSN的纤毛互相交织，支持细胞的核上胞质含有丰富的滑面内质网和代谢酶，例如：细胞色素P450、N－乙酰转移酶，支持细胞的代谢对于吸入外来物质的解毒以及嗅觉功能是非常重要的。支持细胞也被认为有助于调节粘液层的离子组成，这无疑会影响到嗅觉受体和气味之间的相互作用。支持细胞的微绒毛包含阿米洛利敏感的钠通道，而侧表面含有水通道，哺乳动物支持细胞不具备呼吸上皮柱状粘液分泌的糖蛋白的特征。

1.2.1.3基底细胞

嗅上皮含有2种基底细胞—水平状基底细胞和球形基底细胞，水平状基底细胞是沿基底膜排列的扁平细胞，具有很多与呼吸上皮的基底细胞相同的形态学和组织化学特征 （例如，含有角蛋白）。球形基底细胞呈圆形或椭圆形，位于水平状基底细胞之上，胞质比水平状基底细胞染色浅，角蛋白免疫组化呈阴性。水平状基底细胞生成球形基底细胞，部分球形基底细胞是嗅觉感觉神经元的祖细胞，嗅上皮或鲍曼氏腺导管的多能基底细胞可能是支持细胞的祖细胞。

1.2.2鳞状上皮

鼻前庭全部被覆轻度角化、分层的鳞状上皮，由沿基底膜排列的基底细胞和几层鳞状细胞组成，鳞状细胞越接近鼻腔逐渐变扁平，F344大鼠整个鼻腔仅有3.5%被覆鳞状上皮，鼻前庭鼻粘膜的功能类似皮肤的表皮，保护皮下组织免于有害气体物质的损害。

1.2.3移行上皮

复层鳞状上皮的远端和纤毛呼吸上皮近端细胞是无纤毛、微绒毛覆盖表面上皮，被称为鼻无纤毛呼吸上皮或鼻移行上皮。所有种属实验动物和人类的移行上皮共有的特征包括：①解剖部位：鼻腔近端鳞状上皮和呼吸上皮之间；②无纤毛立方形或柱状表面细胞和基底细胞；③罕见杯状细胞和极少的上皮内粘液成分；④与鳞状上皮分界明显，与呼吸上皮分界不明显。啮齿类动物移行上皮较薄 （1～2细胞厚度），假复层，含有3种不同的类型细胞（基底细胞、立方状细胞和柱状细胞）。猴的移行上皮较厚 （4～5细胞厚度），复层，含有至少5种不同类型细胞。被覆鼻腔表面移行上皮细胞具有大量微绒毛。啮齿类移行上皮腔面无纤毛细胞，无分泌颗粒，但有丰富滑面内质网，表明可能有代谢吸入外源性物质的作用。

1.2.4呼吸上皮

实验室动物和人类的大部分非嗅鼻上皮是纤毛呼吸上皮，F344大鼠约46%鼻腔被覆呼吸上皮，呼吸上皮有以下特征：①大鼠呼吸上皮有6种形态不同的细胞类型：粘液细胞、纤毛细胞、无纤毛柱状细胞、立方细胞、刷细胞及基底细胞；②这些细胞沿大鼠粘膜表面分布不均匀：纤毛细胞从近到远沿鼻腔侧壁逐渐增加，而鼻中隔均匀分布。粘液细胞的分布也不均匀，正常大鼠粘液细胞主要位于鼻中隔近端和鼻咽部，啮齿类动物呼吸上皮其余部分的主要分泌细胞是浆液细胞，大鼠和小鼠呼吸上皮的分泌细胞含有丰富的滑面内质网，提示可能有代谢吸入外源性物质的作用；③鼻呼吸上皮含有多种酶，例如：羧酸酯酶、醛脱氢酶、细胞色素P450、环氧化物水解酶和谷胱甘肽S－转移酶等，而且这些酶的分布具有细胞特异性，可能会增强特定的细胞类型化学诱导损伤的易感性或抵抗性。

1.2.5淋巴上皮

淋巴上皮覆盖动物鼻气道固有层分散、灶性鼻相关淋巴样组织 （NALT），啮齿类动物NALT及淋巴上皮局限于鼻咽管开口腹侧壁。淋巴上皮类似于肠道相关淋巴样组织 （gut－associated lymphoid tissues，GALT）及支气管相关淋巴样组织（bronchus－associated lymphoid tissues，BALT），由立方纤毛细胞、少量粘液细胞以及大量无纤毛但有管腔微绒毛的立方细胞 （即M细胞）组成，M细胞被认为参与吸入抗原从鼻腔向底层淋巴结构的吸收和转运。猴的鼻咽部气道也存在NALT及淋巴上皮，数量更多，分布在鼻咽部近端的侧壁和鼻中隔。尽管目前公认NALT鼻腔粘膜免疫中起着关键作用，但吸入药物对NALT的毒性尚未成为研究的重点，Kuper等人建议吸入毒性研究的标准指南应常规进行NALT的组织病理学检查[7]。

2 常用实验动物组织病理学检查鼻腔上皮的取材方法

确定实验室动物鼻损伤的确切部位是理解损伤发病机理的第一步，因此，需要使用一致的方法来分析和记录病变的分布。Young于1981年首次提出了用于组织病理学检查大鼠鼻腔上皮的取材方法，共切取4个横截面：第一个切面在上切牙后；第二个切面切牙乳头；第三个切面沿第2腭嵴；第四个切面与第一上磨牙水平，该取材方法适用于急毒和长毒实验，对鼻腔进行全面彻底的检查[8]。Mery等人于1994年报道了F344大鼠和B6C3F1小鼠鼻腔的系列切面图，用于记录毒性研究的鼻病变的分布[9]。Harkema等人于1987年首次提出猴鼻腔的取材方法，需要垂直于硬腭取4个面：第一个切面在第一前磨牙前；第二个切面在第一、第二前磨牙之间；第三个切面在第一、第二磨牙之间，包括鼻腔旁边的上颌窦；第四个切面在鼻咽部软腭前端和后端的中间位置[10]。Walsh等人于1998年报道了比格犬的鼻的取材方法，也切取4个横截面：第一个切面平行于上切牙的颊面切取；第二个切面在第一前磨牙前；第三个切面在第三前磨牙前；第四个切面在第一磨牙前[11]。Pereira等人于2011年报道了吸入研究兔鼻腔的取材方法，也取4个面：第一个切面在上切牙后，切牙乳头上；第二个切面沿第1腭嵴；第三个切面在第一上前磨牙之前；第四个切面在第一上磨牙之前[12]。

3 吸入药物引起的鼻上皮细胞损伤

3.1 局部剂量和病变分布

实验室啮齿类容易受到多种外源性物质的损伤，化学药物通过吸入或非吸入途径可引起鼻损伤，包括非肿瘤性 （例如：炎症、上皮细胞坏死、上皮增生/化生）和肿瘤性病变。药物引起鼻损伤通常表现特征性、部位特异性分布，例如：甲醛诱导的大鼠鼻病变通常局限于鼻前部被覆移行和呼吸上皮的区域；甲基溴引起的鼻损伤局限于嗅上皮，移行上皮和呼吸上皮未受累。啮齿类鼻损伤在被覆鼻气道的5种主要上皮类型的部位特异性均有报道，啮齿类和非人灵长类臭氧和甲醛的部位特异性病变亦有详细描述[13－17]。鼻损伤的分布与局部剂量、区域性组织的易感性、气流等因素有关，区域性组织的易感性通常是局部代谢的结果，但是局部剂量受除了代谢外气流、粘液流、血流、化学品的理化性质及其它因素的影响[18]。

3.2 化学诱导的鳞状上皮和移行上皮损伤

鼻鳞状上皮比移行上皮和呼吸上皮对损伤更耐受，二甲苯、戊二醛、氨及氯化氢可引起鼻鳞状上皮的损伤，可能的原因是这些化学物的腐蚀性、挥发性以及局部高剂量，而不是细胞易感性。鳞状上皮的急性改变通常是糜烂或溃疡，伴或不伴有炎症，长期暴露改变包括增生或角化过度。

鼻移行上皮与鳞状上皮相比，对某些药物更敏感，暴露于刺激性较小的氧化剂，如臭氧和氯气可使实验动物的移行上皮出现增生和化生，在此之前常有急性炎症。急性短期臭氧暴露引起的鼻炎症和增生性反应在移行上皮粘液细胞化生出现时有所减轻，其可能的原因是这些新形成的上皮内粘液物质，伴分泌增加的粘蛋白，可保护鼻上皮固有层，防止持续臭氧暴露的进一步损伤。但是，长期的臭氧暴露可引起慢性鼻炎、移行上皮增生与粘液细胞化生，以及鼻腔近端粘液流速降低[19]。这些结构和功能的变化可显著改变上呼吸道的一个重要防御机制—粘液纤毛清除功能，使远端的呼吸道容易受到吸入的外源性化学物质的影响。

3.3 化学诱导的呼吸上皮损伤

呼吸上皮的损伤可较表浅或延伸到固有层，刺激物对呼吸上皮常见的表浅、可逆性变化是鼻腔近端表面纤毛的减少或丧失。暴露于氯气的大鼠和小鼠以及暴露于臭氧的猴均可见上述变化。露于臭氧的猴还可见纤毛细胞坏死、粘液细胞增生和炎症。啮齿类和猴均对甲醛长期暴露敏感，病理改变包括：粘液细胞和纤毛消失、上皮细胞变性和坏死、再生上皮增生伴或不伴鳞状上皮化生及炎症反应。甲醛诱导的大鼠呼吸和移行上皮毒性研究发现：急性暴露后细胞增殖增加，细胞毒作用和上皮细胞增殖增加，在甲醛引起鼻腔肿瘤发生发展中发挥着至关重要的作用[20]。

3.4 化学诱导的嗅上皮改变

化学物诱导的嗅上皮非肿瘤性改变包括：细胞变性、坏死、萎缩、增生和化生，改变的种类取决于药物作用的机制和局部剂量。嗅上皮细胞非特异性坏死可发生于直接作用的刺激物，如氯和二氧化硫。嗅上皮的细胞特异性毒性是感觉或支持细胞的变性和坏死。对于许多吸入的化学刺激物，内衬嗅上皮的背内侧鼻腔是损伤的常见部位，其他嗅上皮药物可导致更复杂的鼻内嗅上皮损伤模式，不论是通过吸入或其它给药途径，而且化学诱导的损伤鼻内部位可局限于嗅上皮和/或下面的鲍曼氏腺及邻近的骨质[11，21]。嗅上皮坏死和剥落后的修复可生成对吸入的外源性物质更耐受的上皮屏障—鳞状上皮和呼吸上皮化生，鳞状上皮化生是呼吸上皮和移行上皮损伤的常见反应，但嗅上皮罕见，呼吸上皮化生在嗅上皮较常见，导致类似于呼吸上皮的上皮类型出现。

4 使用吸入药物的动物数据来评估人类风险

吸入药物人类风险的评估非常复杂，可通过直接观察暴露人群，更多是依靠实验室动物的毒性实验结果的外推。1995年McClellan提出了被广泛接受和倡导的评估鼻药物的人类风险的研究策略，即基于针对性方法来收集机制性数据来阐明暴露、剂量－反应之间的定量关系。当动物出现部位特异性毒性反应时，例如药物诱导的鼻气道损伤，测定或预测的局部剂量结合损伤部位来评估组织反应发生时剂量的相对作用。假定有方法可以预测人类的局部剂量，局部剂量和机制知识可用于准确将动物数据外推到人类来进行人类健康风险的评估[22]。吸入药物风险评估的关键是准确确定实验室动物鼻气道靶上皮细胞的剂量，并将动物的局部剂量和细胞毒性数据外推到人类。多个实验室建立了多种数学模型或研发了基于计算机的多种模型，例如计算机流体动力学模型，来解决鼻局部剂量问题[23－25]。通过使用计算机模型并结合鼻组织病理学数据，有可能找到与特定的化学诱导鼻损伤有关的剂量 “热点”，然后可以预测相同吸入化学物在人鼻气道的剂量 “热点”，以及与动物实验确定的动物鼻气道的毒性剂量相对应的人类 “热点”的剂量水平。理解特定的组织/细胞易感性及鼻药物诱导损伤有关的细胞/生化机制是准确风险评估的关键，确定动物种属与人类形态相似的鼻组织/细胞的剂量－反应的相似和不同之处非常重要，目前，这方面的信息非常少，是今后鼻毒理研究的重点和难点。

5 非吸入途径给药实验引起的鼻病变

吸入途径给药实验引起呼吸道病变的描述很仔细，但是非吸入途径给药实验呼吸道组织的病变，尤其是上呼吸道的病变经常会遗漏。通过常规详细检查上呼吸道，尤其是鼻腔，上呼吸道病变的检出率比预期高很多。非吸入途径给药实验检出的病变与吸入途径给药实验的病变形态上相似。下述病变主要是美国国家毒理项目 （National Toxicology Program，NTP）大小鼠实验所观察到的病变[26]。

5.1 鼻非肿瘤性病变

鼻非肿瘤性病变包括：呼吸上皮增生，嗅上皮变性、坏死和萎缩，嗅上皮化生为呼吸上皮以及化生的呼吸上皮的增生。

呼吸上皮增生的特征是柱状细胞数目增多，形成多个短乳头状上皮突起，多个内陷或 “隐窝状”结构，粘膜和粘膜下层常见多核和单核炎症细胞浸润，粘膜下腺体扩张。呼吸上皮增生常见于鼻中隔、鼻甲和腹侧筛窦鼻甲[27]。

嗅上皮变性和/或萎缩的特征是嗅上皮层变薄和/或结构紊乱，变性的早期表现是细胞间隙增加和上皮不连续，随后出现空泡化、凋亡和坏死。感觉神经元是嗅上皮对损伤最敏感的细胞，感觉神经元的丧失会导致神经萎缩，但不是所有引起嗅上皮病变的化学物均发生神经萎缩。

损伤的嗅上皮可修复或发生呼吸上皮化生，化生主要发生在被覆嗅上皮的鼻中隔、鼻甲和筛窦鼻甲，形态上表现为嗅上皮被呼吸上皮代替，化生的呼吸上皮常继发增生，形成短乳头状上皮突起。嗅上皮呼吸上皮化生有时可伴炎症，嗅上皮呼吸上皮化生多继发于嗅上皮变性/再生[28－29]。

呼吸和嗅上皮经常可见均质玻璃样球状物，诊断为嗜酸性小滴、玻璃样物积聚或均质滴状玻璃样物质积聚。超微结构表现为膜结合性椭圆形小体，可能为扩张的粗面内质网，考虑为老年性非特异性改变。

5.2 鼻肿瘤性病变

非吸入途径给药诱导的鼻肿瘤包括：腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌和神经母细胞瘤。

息肉状腺瘤是鼻腔最常见的腺瘤，发生在前鼻腔的鼻甲、上颌鼻甲或鼻腔侧壁的呼吸上皮。

腺癌发生于呼吸上皮或腺体结构，发生于呼吸上皮的腺癌呈外生性或横向延伸生长；发生于腺体结构的腺癌形成圆形、多面体形或者形成纺锤形细胞的实性条索。

鳞状细胞癌可发生在鼻腔的任何部位，起源于鼻前庭、腹侧鼻道或鼻腭管的鳞状上皮，但更常出现在发生鳞状上皮化生的呼吸、移行或嗅上皮区域。鳞状细胞癌由巢状或条索状鳞状上皮细胞组成，伴不同程度的间变和角化珠形成，鳞状细胞癌常呈扩张性生长及浸润周围组织[30]。

起源于嗅上皮的肿瘤相当多变，细胞来源不借助特殊技术难以确定，这些肿瘤有各种各样的名称，例如：嗅神经母细胞瘤、嗅癌、神经上皮瘤及神经上皮癌等等，由于可能会发生形态多样以及确定细胞来源困难，这些肿瘤往往统称为神经母细胞瘤，建议使用神经上皮癌这个术语，因为它包括了嗅上皮感觉神经元、支持细胞、基底细胞或鲍曼氏腺细胞来源的各种肿瘤[30]。Brown等人描述了3种神经母细胞瘤的特征，第一种由支持细胞特征的细胞形成实性团块，形成腺样结构或玫瑰花环；第二种具有感觉神经元特征：细胞嗜碱性，核深染，大核浆比，形成条带状、片状细胞、腺样结构和/或玫瑰花环；第三种特点是内生性增生的上皮细胞呈融合性生长，形成片状或小叶状细胞团，核大，边缘化染色质和单个大核仁[31]。

5.3 非吸入途径给药实验引起的鼻病变的机制

非吸入途径给药实验引起的鼻病变的可能机制包括：①通过脉管系统运输到鼻上皮组织引起的暴露；②化学物代谢生成的有毒代谢产物在鼻积聚；③鼻呼出有毒代谢产物的影响；④通过饮水给药时吸入挥发性物质；⑤灌胃给药时药物的返流等[26]。

6 鼻上皮细胞毒性毒理学的重要性和发展前景

毒性病理学在药物安全评价中占有重要的地位，因为动物的急毒实验、长毒实验和致癌试验都离不开毒性病理学的检查和诊断，而且试验的周期越长，毒性病理学检查的结果越为重要。毒性病理学回答药物造成病理性损伤部位、程度、性质和预后等基本问题。因此，毒性病理学是毒理学中最为重要的组成部分，也是临床前安全性评价工作中最基本的环节。鼻腔给药具有许多其他给药途径无法比拟的优越性，使鼻腔给药制剂迅速发展，鼻腔给药系统已成为一个研究热点。鼻的结构和功能复杂，鼻腔是许多吸入药物和非吸入药物的靶器官，希望本文介绍不同种属动物鼻的解剖和鼻上皮的特点，组织病理学检查时大鼠、猴、犬和兔鼻系统性取材方法，吸入药物研究的鼻上皮损伤特点，以及非吸入途径给药实验引起的鼻病变的组织病理学特征，能帮助提高国内实验动物鼻上皮细胞毒性毒理学的制片和诊断水平。目前，狗和非人灵长类在吸入和非吸入途径给药药物临床前安全性评价鼻上皮毒性毒理学的研究方兴未艾，有很大的发展空间和实用价值。

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