FLT3-ITD、NPM 1和C-KIT基因突变在成人急性髓系白血病中的表达及临床意义

刘南，夏建胜，桑玉旗，卢秀霞，杨书环，齐云飞

（附属菏泽市立医院，山东菏泽274031；⋆菏泽医学专科学校）

FLT3-ITD、NPM 1和C-KIT基因突变在成人急性髓系白血病中的表达及临床意义

刘南，夏建胜，桑玉旗，卢秀霞，杨书环，齐云飞＊

（附属菏泽市立医院，山东菏泽274031；⋆菏泽医学专科学校）

目的探讨成人急性髓系白血病患者中FLT3-ITD、NPM1、C-kit基因突变表达及临床意义。方法采用PCR技术检测50例成人急性髓系白血病患者治疗前后FLT3-ITD、NPM1、C-kit表达，比较分析FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变与临床资料、细胞遗传学的关系及预后影响。结果50例急性髓系白血病中NPM1突变检出率占38%，在正常核型占61.9%，显著高于在异常核型（P＜0.05）；FLT3-ITD突变检出率32%，正常核型占38.1%，与在异常核型相比无显著性差异(P＞0.05)；C-kit突变检出率10%，核型为t(8;21)占80%。FLT3-ITD、NPM1突变初诊时WBC、LDH、α-HBDH显著高于无突变患者（P＜0.05)；在NPM1突变患者中伴FLT3-ITD突变占68.42%，显著高于在无NPM1突变患者中伴FLT3-ITD突变占的9.68%（P＜0.05）；单纯NPM1突变CR率100%，显著高于无三基因突变的患者54.16%（P＜0.05），FLT3-ITD、NPM1突变CR率46.15%，显著低于单纯NPM1突变CR率100%（P＜0.05）。CR的患者FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变均转阴，复发患者再次检出突变早于骨髓复发。结论FLT3-ITD、NPM1及C-kit基因突变在急性髓系白血病上有特殊的分布，并且与白细胞数、骨髓原始细胞比例、血小板数、LDH、α-HBDH密切相关，三基因突变可作为判断预后及监测微小残留病灶的指标。

FLT3-ITD；NPM1；C-kit；急性髓系白血病；基因突变

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是造血系统的具有细胞遗传学和分子遗传学的一种异质性疾病。在AML的发病中，细胞遗传学改变是判断预后的重要依据，往往出现染色体的异常，而约40%～50%的AML患者的细胞遗传学特征是正常核型。对于正常核型的AML，在诊断、预后分层和微小残留病灶的监测上是目前遇到的一大难题，因此，一些特征性的基因突变对于亚型分类和预后评估有着重要的意义。FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）基因的内部串联重复（internal tandem duplication，ITD）基因发生突变,导致造血细胞的增殖、分化及凋亡异常,引起白血病的发生。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM、或NPM1)基因突变造成所编码的穿梭蛋白定位信号异常，使该蛋白在胞质中异常聚集，其引起的下游通路改变可能参与白血病形成[1]。C-kit是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一,其作为干细胞因子的受体，可以通过一系列信号通路参与造血干细胞增殖分化的调控。本研究对50例成人AML患者FLT3-ITD、NPM1及C-kit基因突变进行检测，旨在探讨FLT3-ITD、NPM1、C-kit基因突变在成人AM患者的发生率、分析其与临床特征、疗效及预后关系，证明其是判断预后及监测微小残留病灶的指标。现报道如下。

1临床资料

1.1一般资料收集我院血液科2011—2012年住院的50例初诊的成人AML患者，所有患者诊断均基于骨髓形态学、细胞遗传学、免疫学以及融合基因检查，均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》（第3版）[2]。其中男22例，女28例，中位年龄45岁（18～78岁）。按FAB分型，M18例，M218例，M31例，M46例，M516例，M61例。

1.2方法检测初诊AML患者FLT3-ITD NPM1C-kit基因突变，之后予患者化疗，化疗方案为DA方案: Ara-C100～200 mg/(m2·d）×7 d＋柔红霉素40mg/(m2·d）×3 d（7＋3方案）；急性早幼粒细胞白血病患者采用维甲酸10mg/次，4次/日诱导分化治疗,疗效判断均按张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》第3版[2]评价。动态检测FLT3-ITDNPM1C-kit基因突变阳性患者化疗后（CR后3～4疗程）表达。收集患者的临床特征、外周血象、骨髓形态学、免疫学、遗传学、分子生物学，治疗效果等临床资料。基因检测方法:抽取患者骨髓血或外周血3mL,从其中提取基因组。1）采用特异性引物扩增FLT3外显子14& 15，经毛细管电泳进行片段分析，通过扩增片段大小的不同来判断FLT3-ITD的状态。2）采用特异性引物扩增NPM1基因exon12，经毛细管电泳进行片段分析，通过扩增片段大小的不同来判断NPM1 exon12的基因状态。3）通过特异性引物扩增C-kit基因exon8和exon17序列，扩增的PCR产物采用sanger测序法进行双向测序，将测序所得的序列与NCBI参考序列进行对比，分析C-kit基因的基因状态。

2结果

2.1 FLT3-ITD、NPM 1、C-kit突变在AML各形态学亚型的分布在50例AML中检出16例(32%)FLT3-ITD突变，占32%，其中M15例，M22例，M42例，M57例，以M5为多。FLT3-ITD突变检出率在M1中为62.5%，M2中为11.11%，M4中为33.33%，M5中为43.75%，以M1检出率最高。在50例AML中检出19例NPM1突变，占38%，其中M14例，M25例，M42例，M58例，以M5为多。NPM1突变检出率在M1中为50%，M2中为27.78%，M4中为33.33%，M5中为50%，以M1、M5检出率最高。在50例AML中检出5例C-kit突变，占10%，均为M2，其中M2b4例，核型均为t(8; 21)。

2.2 FLT3-ITD、NPM 1、C-kit突变与传统细胞遗传学的关系在50例AML患者中，核型可供分析的有43例。正常核型21例，其中FLT3-ITD突变有8例，NPM1突变13例，C-kit突变1例。异常核型的患者22例，其中FLT3-ITD突变有6例，NPM1突变5例，C-kit突变4例（均为t(8;21)。FLT3-ITD突变患者在正常核型占38.1%，在异常核型占27.27%，两者相比无显著性差异(P＞0.05)。NPM1突变患者在正常核型占61.9%显著高于在异常核型占22.73%（Z=-2.038，P=0.042，P＜0.05)。

2.3 FLT3-ITD、NPM 1、C-kit突变的一般临床资料分析FLT3-ITD突变AML患者中位年龄为44（18～68）岁，无FLT3-ITD突变的AML患者中位年龄为47（18～78）岁，两者相比无显著性差异(P＞0.05)。FLT3-ITD突变AML患者初诊时白细胞数、骨髓原始细胞比例、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）显著高于无FLT3-ITD突变患者（P均＜0.05)，白细胞数数、骨髓原始细胞比例、LDH高的更加明显（P均＜0.01)；FLT3-ITD突变AML患者初诊时血小板数、骨髓巨核细胞数与无FLT3-ITD突变患者比较两者无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

NPM1突变AML患者中位年龄为43（18～68）岁，无FLT3-ITD突变的AML患者中位年龄为46（18～78）岁,两者相比无显著性差异(P＞0.05)。NPM1突变AML患者初诊时白细胞数、血小板数、LDH、α-HBDH显著高于无NPM1突变患者（P＜0.05)，白细胞数、LDH更加明显（P均＜0.01)；NPM1突变AML患者初诊时骨髓原始细胞比例、骨髓巨核细胞数与无NPM1突变患者比较两者无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

FLT3-ITD、NPM1突变AML患者初诊时白细胞数、骨髓原始细胞比例、LDH、α-HBDH显著高于无FLT3-ITD、NPM1突变患者（P＜0.05)，白细胞数、骨髓原始细胞比例、LDH更加明显（P均＜0.01)；FLT3-ITD、NPM1突变AML患者初诊时血小板数、骨髓巨核细胞数与无FLT3-ITD、NPM1突变患者比较两者无明显差异（P＞0.05)。见表3。

表1 FLT3-ITD突变与一般临床资料关系（±s）

表1 FLT3-ITD突变与一般临床资料关系（±s）

P＞0.05，*P＜0.05。

组别n WBC PLT原始细胞比例巨核细胞LDHα-HBDH（×109/L）（×109/L）（个）（U/L）（U/L）FLT3-ITD＋16 140.78±137.49 55.81±48.10 0.84±0.084 26.88±56.58 1182.19±319.63 869.31±847.19 FLT3-ITD－34 21.65±26.64*56.94±58.70 0.69±0.15*21.91±38.85 389.76±290.24*378.97±343.41

表2 NPM1突变与一般临床资料关系（±s）

表2 NPM1突变与一般临床资料关系（±s）

P＞0.05，*P＜0.05。

组别n WBC PLT原始细胞比例巨核细胞LDHα-HBDH（×109/L）（×109/L）（个）（U/L）（U/L）NPM1＋19 95.2±121.62 73.11±55.25 0.75±0.17 35.79±59.66 1005.89±1239.34 724.89±774.55 NPM1－31 38.61±73.27*46.1±53.04*0.73±0.14 5.83±31.00 422.17±370.10*421.4*±425.89

表3 FLT3-ITD、NPM1突变与一般临床资料关系（±s）

表3 FLT3-ITD、NPM1突变与一般临床资料关系（±s）

P＞0.05，*P＜0.05。

组别n WBC PLT原始细胞比例巨核细胞LDHα-HBDH（×109/L）（×109/L）（个）（U/L）（U/L）FLT3-ITD＋NPM1＋16 132.23±132.07 59.69±48.05 0.84±0.08 32.85±61.60 1295.15±1418.06 906.08±884.27 FLT3-ITD－NPM1－34 23.14±29.01*46.89±53.86 0.72±0.14*17.48±32.31 392.11±317.59*389.33±376.92*

2.4 FLT3-ITD、NPM 1、C-kit突变之间的关系19例NPM1突变的AML患者中伴有FLT3-ITD突变的13例与31例无NPM1突变的AML患者中伴有FLT3-ITD突变的3例相比其差异具有显著性（Z=-4.279，P=0.000)。16例FLT3-ITD突变的AML患者中伴有NPM1突变的13例与34例无FLT3-ITD突变的AML患者中伴有NPM1突变的6例相比其差异具有显著性（Z=-4.279，P=0.000)。16例FLT3-ITD突变的AML患者中伴有C-kit突变的1例与34例无FLT3-ITD突变的AML患者中伴有C-kit突变的4例相比两者无显著性差异(P＞0.05)。19例NPM1突变的AML患者中无一例伴有C-kit突变与31例无NPM1突变的AML患者中伴有C-kit突变的5例相比其差异明显(P＜0.05)。

2.5 FLT3-ITD、NPM 1、C-kit突变对疗效的影响

FLT3-ITD+NPM1+C-kit-者13例，CR 6例，占46.15%；FLT3-ITD-NPM1+C-kit-者6例，CR 6例，占100%，两者比较P＜0.05。FLT3-ITD+NPM1+者13例，CR 6例，占46.15%；FLT3-ITD+NPM1-者3例，CR 2例，占66.67%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITD+ NPM1-C-kit-者2例，CR 1例，占50%；FLT3-ITD+ NPM1-C-kit+者1例，CR 1例，占100%，两者相比，P＞0.05。FLT3-ITD+NPM1-C-kit+者1例，CR 1例，占100%；FLT3-ITD-NPM1-C-kit+者4例，CR 3例，占75%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITD-NPM1-C-kit-者24例，CR 13例，占54.16%；FLT3-ITD-NPM1+ C-kit-者6例，CR 6例，占100%，两者比较P＜0.05。FLT3-ITD+NPM1+C-kit-者13例，CR 6例，占46.15%，FLT3-ITD-NPM1-C-kit-者24例，CR 13例，占54.16%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITD-NPM1-C-kit-者24例，CR 13例，占54.16%；FLT3-ITD+者16例，CR 8例，占50%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITDNPM1-者24例，CR 13例，占54.16%；C-kit+者5例，CR 4例，占80%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITDNPM1+者6例，CR 6例，占100%；C-kit+者5例，CR 4例，占80%，两者比较P＞0.05。FLT3-ITD-NPM1+者6例，CR 6例，占100%；FLT3-ITD+NPM1-者3例，CR 2例，占66.67%，两者比较无显著性差异（P＞0.05）。

NPM1突变伴无FLT3-ITD、C-kit突变患者2疗程CR率显著高于无FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变的患者CR率（P＜0.05)。FLT3-ITD、NPM1突变伴无C-kit突变患者2疗程CR率显著低于与NPM1突变伴无FLT3-ITD、C-kit突变患者CR率（P＜0.05)。

2.6监测治疗后FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变转变情况所有达CR的患者FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变均转阴，未达CR患者FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变仍存在，复发的2例患者（均有FLT3-ITD、NPM1突变无C-kit突变）于复发前约1个月均再次检测到FLT3-ITD、NPM1突变。

3讨论

随着对肿瘤生物学遗传因素的不断认识，发现细胞遗传学和分子遗传学是影响成人AML预后重要的独立因素[3]。AML中有很多特征性的分子水平异常，包括基因的突变、表达水平等[4-5]，这些基因的突变为染色体正常的患者判断预后、危险度分级提供了重要依据。

本研究从50例AML患者的检测到19例NPM1突变的患者，其中约61.9%为正常核型显著高于异常核型患者中NPM1突变检出率，证明NPM1突变较易发生于正常核型AML患者中，与国外文献[6]报道一致。本研究NPM1突变检出率最高是AMLM1、M5，与国内研究一致[7]。本研究NPM1突变患者初诊时白细胞数、血小板数、LDH、α-HBDH往往较高，且伴有FLT3-ITD突变的患者白细胞数更高，这与国外文献[8]报道相似。

本研究从50例AML患者检测到16例FLT3-ITD突变的患者，其中约57.14%为正常核型，异常核型患者中FLT3-ITD突变检出率42.8%，相比两者无明显差异，证明FLT3-ITD突变在正常、异常核型中表达无差异。FLT3-ITD突变检出在AML各型中以AMLM5数量最多，但突变比例以AMLM1最高，说明FLT3-ITD突变易发生在AMLM1、M5中。本研究结果显示FLT3-ITD突变AML患者初诊时白细胞数、骨髓原始细胞比例、LDH、α-HBDH高，白细胞平均值: 140.78×l09/L，示肿瘤负荷量大，示FLT3-ITD突变是预后不良的指标。

Keely LM[3]等认为在AML的发病过程中，单一的基因突变和染色体异常并不足以致病，AML是多个遗传事件共同参与的结果，AML发病的二次打击主要来自于两方面累计的相关基因突变的共同作用:I类突变:是以持续激活的酪氨酸激酶而影响下游生长因子为代表的突变，此类突变促使造血前体细胞获得增殖或（和）生存优势；Ⅱ类突变:以维持造血系统分化的重要转录因子通过融合基因和点突变的形式丧失功能，此类突变促使细胞分化受阻和凋亡异常。

本研究NPM1突变的AML患者中FLT3-ITD突变检出率高达68.42%，远远高于无NPM1突变的患者；FLT3-ITD突变AML患者中NPM1突变检出率为81.25%，显著高于无FLT3-ITD突变的患者，证明FLT3-ITD突变与NPM1突变密切相关，且两者易伴发。本研究显示C-kit突变与FLT3-ITD突变及NPM1突变无明显伴发迹象。本研究50例AML患者中仅检测到5例C-kit突变，其中4例为t(8；21)的AMLM2b，8例AMLM2b中有4例检测到C-kit突变（50%），证明C-kit突变易发生在为t(8；21)的AMLM2b中。

本研究NPM1突变无FLT3-ITD、C-kit突变的AML患者对诱导化疗反应最好，CR率最高，NPM1突变伴无FLT3-ITD、C-kit突变患者2疗程CR率显著高于无FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变的患者，说明单纯NPM1突变是预后好的指标；FLT3-ITD、NPM1突变伴无C-kit突变患者两疗程CR率显著低于与NPM1突变伴无FLT3-ITD、C-kit突变患者，说明FLT3-ITD、NPM1突变是预后较差的指标。仅仅NPM1突变AML患者对化疗反应较好可能与胞质NPM1作用于NF-KappaB,减弱其活化密切相关[9],而NPM1突变导致核仁失去完整性可能是其原因之一[10]。FLT3-ITD突变伴NPM1突变患者化疗反应及预后差，可能与FLT3-ITD通过STAT5诱导细胞抗凋亡及促进细胞增殖相关[8]。

本研究FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变的患者治疗后均予监测，所有CR患者CR后FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变均未检测到，未达CR患者FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变仍存在；2例复发患者在骨髓复发前1个月检测到本已于CR后转阴的FLT3-ITD、NPM1突变，说明若FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变AML患者在血液学CR该突变转阴后再次检测到突变，则预示会出现AML患者复发，进一步证实FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变是评估预后、监测微小残留病灶的指标；且FLT3-ITD、NPM1、C-kit突变在整个病程中表现出明显的稳定性[11-12]，故可作为监测微小残留病灶的很重要的指标之一。

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Exp ression of FLT3-ITD、NPM 1 and C-k it Gene M u tation in Adu lt Acu te M yeloid Leukem ia and The Clinical Significance

Liu Nan，X ia Jiansheng，Sang Yuqi，Lu X iux ia，Yang Shuhuan，Qi Yunfei
（Heze MunicipalHospitalAffiliated to Heze MedicalCollege，Heze 274031，Shandong；Heze MedicalCollege）

Ob jectiveTo investigate and discuss the expression and clinical significance of FLT3-ITD、NPM 1、C-kit in adult patientsw ith acutemyeloid leukemia.M ethodsThe expression of FLT3-ITD、NPM 1、C-kitwere detected before and after treatmentby PCR in 50 cases of adultpatientsw ith AML.Technology and comparated analye is the ralutionship of FLT3-ITD NPM 1 C-kitmutation w ith clinical data,cytogeneticsand prognosos.Resu ltsIn 50 cases of AMLNPM 1mutation positie is 38%,the normal karyotype group was significantly higher than abnormal karyotype（61.9%vs38%P＜0.05）；FLT3-ITD mutation positie rate is 32%. Therewasno statistialdiffenencebetween normalkaryotypeand abnormalkaryotype(38.1%vs27.27%P＞0.05)；C-kitmutation positie rate is 10%，among these patienis 80%was detected.WBC、LDH、-HBDH was significantly higher in new ly diaynosed patients w ith FLT3-ITD and NPM 1mutation than thatw ithout themutation（P＜0.05).In NPM 1mutation positie pationts FLT3-ITD mutation positie ratewasmuch higer than NPM 1 negatie FLT3-ITD positie rate(68.42%vs9.68%P＜0.05）；The CR rateof Simple NPM 1 mutation was higher than these three gene negatie and both NPM 1 and FLT3-ITD positie(100%vs54.16%P＜0.05),FLT3-ITD, NPM 1,C-kitmutations positie patientswho got CR turned to negatie.It is early bonemarrow relapse that the time thatmutation detected again was earlier than bonemarrow relapse in patient.Conclusion T here is special distribution of FLT3-ITD NPM 1 C-kit gene mutation in AML patients.And closely related to the WBC number，PLT number，percentage of bone marrowblasts，LDH-HBDH,FLT3-ITD NPM 1C-kitgenemutation can be the index to assessandmonitorminimal residualdisease.

FLT3-ITD；NPM 1；C-kit；acute myelocytic leukem ia；adult；genemutation

R733.7

：A

：1008-4118（2013）01-0008-05

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.01.03

2013-01-13