大鼠灌胃冬凌草乙素的药代动力学研究

杜鹏强， 李晓天， 石迎迎， 于 彤

(1．郑州大学 药学院 河南郑州450001;2．河南省人民医院 河南郑州450001)

0 引言

冬凌草系唇形科植物碎米桠Rabdosiarubescens(Hemsl．)Hara的全草，主要分布于河南及黄河流域以南，主产地在河南济源太行山一带［1］，其味甘苦，性微寒，主要用于咽喉肿痛、扁桃腺炎、蛇虫咬伤等症．临床实验证明冬凌草对食管癌、贲门癌、肝癌等有一定疗效［2－5］．冬凌草乙素作为冬凌草的抗肿瘤有效成分之一，具有显著的抗血管原活性而抑制前列腺癌的发展和转移［6］，能在体外诱导肺癌细胞凋亡［7］，能显著抑制人乳腺癌和肝癌细胞的生长［8－9］，抑制髓细胞性白血病细胞增殖及单核细胞性白血病细胞的生长［10－11］．到目前为止，关于冬凌草乙素在大鼠体内的药动学研究尚未见报道．本文通过对大鼠灌胃冬凌草乙素，进行临床前药代动力学研究．

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，包括G1322A型在线真空脱气机，G1311A型四元输液泵，G1313A型自动进样器，G1316A型柱温箱及G1314A型可变波长紫外检测器．冬凌草乙素由郑州大学新药研发中心提供;非那西丁(内标)Sigma-Aldrich公司产品;甲醇为色谱纯，乙酸乙酯为分析纯，均为天津四友化学试剂有限公司产品;超纯水为美国Milli-Q超纯水系统．

1．2 动物

健康成年SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由河南省实验动物中心提供．

1．3 色谱条件

色谱柱为 Eclipse XDB C18 柱((150 mm ×4．6 mm，5 μm);美国 Agilent公司);预柱为 C18 柱((12．5 mm ×4．6 mm，5 μm);美国 Agilent公司);流动相为甲醇 － 水(46∶54，V/V);流速为 1．0 mL/min;进样量为20 μL;柱温为25℃;检测波长为232 nm．

1．4 血浆样品处理

100 μL 大鼠血浆中，加入10 μL Vc 溶液(20 g/L)，10 μL 内标(IS)溶液 (20 μg/L 非那西丁)，涡旋混匀30 s，加入3 mL乙酸乙酯，涡旋震荡3 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液于40℃真空浓缩至干，残渣加100 μL流动相复溶，13 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL注入 HPLC仪进样分析．

1．5 实验方法

SD大鼠6只，雌雄各半，给药前12 h禁食，自由饮水．以20 mg/kg的剂量对大鼠进行灌胃给药．给药前采集空白血样，给药后分别于 0．083，0．25，0．5，1．0，1．5，2．0，3．0，4．0，6．0，8．0，12．0，24．0 h 于眼眶静脉丛采血300 μL置肝素化离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上层血浆100 μL，按1．4操作，注入HPLC仪进行分析．根据当日标准曲线，求得血浆药物浓度．

1．6 数据分析

采用3P97软件进行数据处理，根据试验数据绘制血药浓度－时间曲线，并采用非房室模型法计算各药动学参数:以半对数作图法，由末端相4个浓度点计算消除速率常数ke，并用公式0．693/ke计算半衰期T1/2．采用梯度法计算AUC0－t，并以末端点的血药浓度除以 ke，计算外推至无穷大的 AUCt－∞．清除率 CL由X0/AUC0－∞计算得到．

2 结果

2．1 色谱行为

HPLC法测定冬凌草乙素时，专属性强，灵敏度高．冬凌草乙素和内标非那西丁的保留时间分别为4．61 min和5．69 min(图1)，大鼠血浆中的内源性物质不干扰冬凌草乙素的测定．

图1 冬凌草乙素的色谱图Fig．1 Chromatogram of ponicidin

2．2 冬凌草乙素在大鼠血浆中的标准曲线

取大鼠空白血浆100 μL，加入冬凌草乙素系列标准溶液10 μL，配制成相当于冬凌草乙素血浆浓度分别为 50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 μg/L 的血浆样品，按 1．4 操作，进样 20 μL，记录色谱图;以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，以最小二乘法进行线性回归，求得的回归方程即为标准曲线，标准曲线方程为 y=0．000 147x－0．009 307(r=0．998 1)．

2．3 精密度与准确度

取大鼠空白血浆100 μL，按2．2节的方法配制低、中、高3个浓度(冬凌草乙素的血浆浓度分别为100，1 000和5 000 μg/L)的质控(QC)样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3天．根据当日标准曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的精密度与准确度，数据见表1．实验数据表明，该分析方法符合有关国际规范的要求．

表1 大鼠血浆中乙素的回收率和精密度(n=6，Mean±SD)Tab．1 Recovery and precision of ponicidin in plasma(n=6，Mean±SD)

2．4 方法回收率

取大鼠空白血浆100 μL，加入冬凌草乙素标准溶液10 μL，按1．4操作，配制低、中、高3个浓度(冬凌草乙素的血浆浓度分别为100，1 000和5 000 μg/L)的QC样品，每一浓度进行6样本分析．同时配制相应浓度的冬凌草乙素标准溶液，进样分析．以每一浓度血浆样品与标准溶液中冬凌草乙素的峰面积比值计算回收率．3 种浓度下冬凌草乙素的萃取回收率分别为(74．8 ±4．9)%，(68．8 ±4．5)%，(67．1 ±5．2)%(见表1)．内标非那西丁经同样处理，回收率为(88．9±5．8)%．

2．5 大鼠灌胃给药后药代动力学

6只大鼠灌胃冬凌草乙素20 mg/kg后，测定不同时间的血药浓度，血药浓度—时间曲线见图2．其中B是A的半对数坐标图．

图2 大鼠灌胃给药20 mg/kg乙素后的血药浓度—时间曲线Fig．2 Mean plasma concentration-time curve of ponicidin after i．g．20 mg/kg in rats

采用非房室模型法，求算出各主要药动学参数 AUC0－t，AUCt－∞，ke，T1/2，CL/F，Cmax，Tmax分别为(9．85 ±2．89 mg·h/L，(11．81 ±3．45)mg·h/L，(0．11 ±0．04)h－1，(3．52 ±1．16)h，(1．08 ±0．10)L/(kg·h)，(3．07 ±2．30)μg/L，(0．67 ±0．33)h，见表 2．

3 讨论

本文的血浆样品用乙酸乙酯作为提取溶剂，内标非那西丁和冬凌草乙素在低、中、高各浓度均能获得较高且较稳定的提取回收率．在对冬凌草乙素的结构类似物冬凌草甲素进行考察时发现，在冬凌草甲素与冬凌草乙素达到色谱分离的情况下，冬凌草甲素容易受到血浆中内源性物质的干扰，而非那西丁与冬凌草乙素的色谱保留时间相近且又能完全分开，不受内源性物质的干扰，因此选用非那西丁作为内标物．在考察稳定性时，冬凌草乙素血浆样品室温放置2 h后会降至60%～70%，所以考察了不同浓度及不同体积的酶活性抑制剂氟化钠溶液以及抗氧化剂Vc溶液的稳定作用．实验结果表明，向100 μL 血浆样品中加入 10 μL Vc溶液(20 g/L)，可有效防止冬凌草乙素的降解(RE在±15%内)，保证了测定结果的准确可靠．

本文建立了大鼠灌胃后血浆中冬凌草乙素的高效液相色谱测定法．采用乙酸乙酯对血浆样品进行预处理，以非那西丁为内标，对血浆中的冬凌草乙素进行测定．样品处理过程操作简单，冬凌草乙素在血浆浓度范围内，线性关系良好，定量下限达50 μg/L，该方法专属性强，精密度高，准确可靠，成功的用于冬凌草乙素在大鼠体内的药动学研究．

表2 大鼠灌胃给药20 mg/kg乙素后的主要药代动力学参数(n=6)Tab．2 Main pharmacokinetics parameters of ponicidin after i．g．20 mg/kg in rats(n=6)

通过灌胃这种口服给药方式，对大鼠灌胃冬凌草乙素进行临床前药代动力学的研究，得出相应的药动学参数．从药动学参数T1/2(3．52±1．16)h中，可以得出冬凌草乙素在大鼠体内消除较快，在体内不易蓄积．同时为冬凌草乙素进一步的研究提供依据，特别是为冬凌草乙素的口服给药方式的研究提供依据．

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