podoplanin及重组人血管内皮抑制素和胃癌侵袭转移关系的研究进展

庞凌坤 蒋志庆

(桂林医学院附属医院胃肠外科，桂林市 541001)

胃癌是一种高发肿瘤，往往较早出现淋巴结转移。一旦转移到淋巴结，胃癌患者就难以治愈。胃癌切除后，确诊已转移到淋巴结上的概率达到60%，因此胃癌的五年生存率低于20%。虽然对胃癌的研究越来越深入，但对胃癌如何转移到淋巴道的机制很少有确切的研究结果。胃癌术后复发以及转移的最主要方式是淋巴结转移［1］。淋巴管的生成极大地帮助了肿瘤实现淋巴道转移。检出的淋巴结癌转移数量占检出淋巴结的比例即淋巴结转移率，与胃癌的预后有显著的正相关关系，阳性率越高，预后明显越差［2］。podoplanin是一种小分子黏液样跨膜糖蛋白，在淋巴管的内皮上呈高表达，而在血管内皮上几乎不表达，被普遍地认为是淋巴内皮细胞和淋巴管生成的特异性标志物［3］。有相关的研究表明，无论是在体内还是体外，podoplanin都能介导集合细胞的侵袭和迁移［4］。本文就 podoplanin及重组人血管内皮抑制素与肿瘤侵袭转移的一些新方式作一综述，探讨单细胞和集合细胞转移方式的信号途径，为微创治愈肿瘤提供依据和新的手段。

1 podoplanin的特性、表达和相关机制

1．1 podoplanin的生物学特性 podoplanin是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子大小为38×103［5］，有162个氨基酸，有1个单一高度保守的跨膜区域，胞内域由9个氨基酸构成，细胞质内的C端有2个潜在的磷酸化位点，胞外域在不同的物种间差异较大，但都有相对保守的6个潜在的氧连接型糖基化位点，唾液酸通过α2-3连接在半乳糖上，构成其糖类主要部分。

podoplanin广泛分布于人体多种组织细胞中，如骨骼肌、唾液腺、胎盘、肺、成骨细胞、肾足突细胞、间皮细胞、心脏和乳腺上的肌成纤维细胞，以及鼠的肺器官中肺泡Ⅰ型上皮细胞膜。也有报道［6，7］人的表皮细胞基底层上也可见到podoplanin局部表达。podoplanin主要在淋巴管内皮细胞上呈现高表达，这种高表达的特异性是使得其成为淋巴内皮细胞的标记物。

1．2 生理功能 podoplanin的生理功能目前不是十分清楚 。但是有研究发现［3］，在小鼠出生时如果缺失podoplanin，会导致病理切片上呈现为淋巴管扩张、淋巴管水肿等，从而表现为淋巴管功能异常，最后小鼠死于呼吸衰竭。podoplanin拥有一个诱导血小板聚集域(platelet aggregation inducing factor，PLAG)，此 PLAG 域可以诱导血小板聚集，该诱导作用中起到最重要作用的是其中的唾液酸化核心［8］。在正常组织的发生及修复中，以及癌症的发生发展过程中，podoplanin都起到重要作用。

1．3 podoplanin高表达于癌组织的外周单层肿瘤细胞 在人多种肿瘤组织中podoplanin呈高表达，比如包括肺癌、口腔鳞状细胞癌、喉癌、皮肤癌、卵巢粒层细胞瘤、宫颈癌、食道癌、卵巢的无性生殖细胞瘤，以及部分中枢神经系统中的肿瘤也可存在podoplanin表达上调［9，10］。podoplanin 与表达在卵巢生殖细胞瘤癌胚的M2A抗原生物学特性类似［11］。人们认为肿瘤是纯间变细胞群的无组织结构［12］，最近很多研究的结果更倾向于证实实体瘤内部和边缘存在不同的分子表达模式。有报道称［4］，在98%的鳞癌边缘的单细胞层上可见podoplanin高表达，特别是肺癌、喉癌、宫颈癌、皮肤癌及食管癌发生的鳞癌中。Shibahara J等研究显示［13］，在MCF27乳腺癌细胞中多种因子可诱导podoplanin的表达，比如成纤维细胞生长因子、3T3成纤维细胞中的缓激肽、表皮生长因子以及肿瘤坏死因子。周围组织中的相关因子会影响或者调控podoplanin的表达，但是他们如何影响podoplanin的机制尚不清楚。

1．4 podoplanin在癌发生的鼠模型上绕过EMT 以往对小鼠模型中癌发生过程的研究表明，EMT是在肿瘤恶性进展中的关键事件。这方面的研究最深入的例子是有关胰岛素β细胞瘤生成的Rip1Tag2鼠模型研究。这些鼠表达猿病毒大T抗原，受到胰岛素启动子的调控，胰岛细胞突变形成产胰岛素的β细胞肿瘤;这些β细胞肿瘤表达N2钙黏蛋白，而不是表达E2钙黏蛋白。这种钙黏蛋白转换是EMT的一部分分子事件，为腺瘤发展为腺癌的关键限速过程。而podoplanin表达呈现基因型转变，在没有EMT过程包括没有钙黏蛋白转换的情况，他仍能够导致肿瘤形成。实验结果表明，在没有诱导钙黏蛋白转换和EMT发生的情况下，podoplanin已经在MCF7细胞中强烈表达，在这个动物实验中podoplanin的转换牵扯到单细胞侵袭(有EMT过程)和集合细胞侵袭(无EMT过程)两种模式。发生这些分子过程的这类细胞形成丝足，加强了其迁移的能力［4］。在有表达podoplanin和没有表达podoplanin的 Rip1Tag2鼠β细胞瘤间的区别是，前者的大多数瘤细胞没有发生钙黏蛋白转换，肿瘤亚型也没有表达E2钙黏蛋白。上述的一些实验结果没有证明podoplanin可以抑制钙黏蛋白转换过程，也没有证明他可以抑制EMT，但可以证明其能够介导绕过EMT的肿瘤细胞侵袭机制。并且无论存在不存在EMT，两种不同机制的肿瘤侵袭可以同时存在于一个肿瘤发生发展过程中。

1．5 podoplanin促使肿瘤细胞侵袭、迁移和扩散 Wickia等［4］采用转染法研究podoplanin在正常人角质化细胞和MCF7乳腺癌细胞中的功能，podoplanin的表达增加可以使该细胞发生形态学的巨大变化，比如细胞弹性纤维合成减少，并生成丝足样膜凸起，甚至在存在E2钙黏蛋白表达的情况下依然可以起到这样的作用;相应地，podoplanin的表达使得细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中纤连蛋白的黏附和扩散能力提高。抗整合素中和抗体可以阻断细胞的扩散，ECM和肿瘤细胞之间的互相作用，制造了肿瘤细胞侵袭迁移的条件。在E2钙黏蛋白表达的情况下，podoplanin可以促进MCF27细胞和HaCaT角质细胞迁移 。另外，穿透基质层能力强的细胞往往podoplanin呈高表达。相反，podoplanin不表达或表达下调的细胞穿透基质层的能力显著下降。基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMP)影响细胞侵袭能力的过程能被TIMP2抑制。这些体外实验研究结果显示，癌组织中podoplanin在有没有钙黏蛋白和EMT的条件下也都可以致使癌细胞提高侵袭迁移能力。近来有研究报道［14］，Madin Dabby犬肾细胞 (Madin Dabby canine kidney cells，MDCK)中podoplanin的表达在没有E2钙黏蛋白表达情况下可以提高单细胞的迁移能力。我们以此可以猜测，podoplanin可以诱导集合细胞和单个细胞的迁移，但确切的促进侵袭转移的两种机制还不十分清楚。

1．6 podoplanin调整肌动蛋白细胞骨架 癌细胞侵袭和转移往往依靠调整改变肌动蛋白细胞骨架。一些研究采用免疫沉淀测定法提示，podoplanin本身与肌动蛋白不直接相关。podoplanin调整细胞骨架的机制是:膜蛋白通过 ERM蛋白(如 Ezrin、Radixin和Moesin)结合于肌动蛋白的细胞骨架上，其中的一种Ezrin蛋白能介导丝足形成、诱导转移 已经得到证实［15］。除此之外，研究还发现［16］，在 MDCK细胞、MCF27细胞 以及 HaCaT角质化细胞，podoplanin表达上调可以明显提高ERM蛋白(比如Ezrin蛋白等)的磷酸化，却没有影响他们的(Ezrin或Moesin等)表达水平。就是通过这样的过程，ERM蛋白磷酸化就使podoplanin表达和肌动蛋白细胞骨架的重排密切相关。除了通过ERM蛋白功能，podoplanin也可以调节Rho家族特别是RhoA的GTP酶活性。在MCF27细胞中，podoplanin表达上调影响到RhoA，后者调低内在活性，这个过程的详细分子机制尚不明确，猜测在不同类型的细胞骨架组织中会发生不同的反应［16］。这些研究结果表明，podoplanin表达变化可以抑制RhoA活性，可以降低细胞的移动性，RhoA活性的变化往往会涉及迁移相关表型的表达。

2 重组人血管内皮抑制素与胃癌

对肿瘤病理研究的深入，分子靶向药物已作为肿瘤治疗的重要工具之一。大量实验表明，肿瘤发生侵袭转移在相当程度上需要依靠其血管的生成，所以研究调控血管生长的分子靶向药物有重要意义。血管生成因子和抗血管生成因子之间互相调节，调节的结果决定了血管生长或者抑制，其中的机制涉及到细胞凋亡、细胞增殖、整合、基底膜和细胞外基质的重生与分解，分子靶向药物作用于上述过程的每一环节均可起到调控肿瘤血管生成。

2．1 内皮抑制素特性 内皮抑制素(endostatin，ES)是一种广谱调控血管形成的抑制因子，其分子大小为20 kDa。其氨基排列的顺序与胶原XⅧ C末端的非胶原结构域氨基酸顺序一致。XⅧ C末端的一个裂解片段，其中包含16个酸性氨基酸、29个碱性氨基酸。实验结果显示［17］，NO-环鸟苷酸信号途径可以调节内皮抑制素表达，一些因素比如应激、缺氧和γ-干扰素的刺激能促进ES释放。需要特别提出的是，赋予ES发挥抑制血管内皮细胞生长作用的关键结构区域可能就是其结构中包含的一个特殊的碱性区域。由我国罗永章博士自主创新研发的重组人血管内皮抑制素(recombinanthuman endostatin，rh-es)(商品名:恩度)已通过Ⅲ期临床试验。我国用恩度治疗的消化系统肿瘤主要有胃癌和肝癌。肿瘤需要丰富的血供才能快速的生长，丰富的血供是大体积实性瘤体增大及肿瘤细胞转移的必要基础条件。已经成为共识的是，ES抑制肿瘤血管形成涉及到肿瘤细胞、成纤维细胞等多种成分，最主要的作用“靶点”是血管内皮细胞。恩度抑制新生血管生长的作用机制如下。

2．1．1 通过结合内皮细胞表面多种受体，干扰血管生成促进因子的信号传导 肿瘤丰富血管的形成与否决定于促血管因子和抑血管因子之间的强弱改变。主要的促血管因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)两种。通过竞争的方式，恩度结合硫酸黏蛋白类受体，抑制VEGF和bFGF，使血管内皮细胞的生长受到阻碍，达到减慢肿瘤新生血管生长速度的作用［18］。

2．1．2 调节多种血管形成相关基因的表达，改变信号传导通路中蛋白质的磷酸化状态 Shichiri等［19］研究发现，恩度可调控血管内皮细胞中相关基因的表达现象，主要涉及到一些管家基因的表达改变，最终加速细胞凋亡和减慢增殖内皮细胞。

2．1．3 抑制多种肿瘤相关基质金属蛋白酶原的激活和水解活性 研究证实［20］，ES可抑制如 proMMP-2、proMMP-9、proMMP-13等多种肿瘤相关基质金属蛋白酶原的激活和水解活性，ES还可与MMP-2的活性部位结合而形成较为稳定的复合物，从而产生抑制血管内皮细胞迁徙的作用。

2．1．4 减少内皮细胞增生及其基质蛋白表达，诱导凋亡 恩度可以使血管内皮细胞中的抗凋亡蛋白表达下降，这样就可以加速血管内皮细胞凋亡［21］。ES在血管里能直接进入内皮细胞胞浆诱发Shb发生磷酸化，减少S期细胞所占的比例，从而加快内皮细胞凋亡［22］。

2．2 恩度的临床研究现状 研究表明［23，24］，恩度化疗药物联合用药具有互补作用，因为两者对肿瘤细胞杀伤的机制不相同，联合应用提高抗肿瘤效果，疗效提高明显;并且在肿瘤抑制率方面两者联合给药与两者单独先后给药有提高。由此推测这可能跟药物分别作用于不同的细胞周期有联系，也可能诱导凋亡的机制不同。

2．2．1 恩度联合化疗药应用于胃癌术后的治疗 廖成文［25］以FOLFOX方案+恩度治疗晚期胃癌60例，随机分为FOLFOX方案组和FOLFOX方案+恩度组，实验的有效情况(RR)分别为40%和60%(P＞0．05);胃癌的控制率(DCR)分别为70%和83．13%(P＞0．05)。在同一实验研究中还发现［26］，FOLFOX方案的疗效为40%，与国外随机研究结果非常接近。实验表明，FOLFOX方案联合恩度组总的客观有效率为60%，与对照组相比，统计学上无显著差异，但是恩度联合FOLFOX方案对提高晚期胃癌近期疗效还是有优势的。徐建忠等［27］用FOLFOX4方案+恩度治疗晚期胃癌32例，参与可评估患者31例，其中完全和部分病情缓解有17例，治疗有效率为 54．8%，1年、3年生存率分别为 51．6%和16．1%。研究表明，FOLFOX4方案+恩度治疗晚期胃癌是有效的，对晚期胃癌患者的病情缓解有一定的作用。陈映霞等［28］使用恩度联合不同化疗药物治疗晚期胃癌患者9例，其中FOLFOX4方案应用4例，喜树碱类化疗药物4例，紫杉醇化疗药物1例，总有效率37．5%，疾病控制率87．5%。可以看出恩度联合不同化疗药物有一定的效果，特别对晚期胃癌患者证明是有效的。

2．2．2 恩度在除胃癌以外的其他肿瘤中的联合化疗运用 目前恩度主要是与胃癌的FOLFOX方案联合运用于临床治疗。有必要探索恩度在不同肿瘤中联合不同化疗药物的疗效。从临床研究来看，研究的病例数目较小，有待进行临床大样本的研究。恩度的Ⅰ～Ⅲ期临床试验结论已经提示其最适剂量为7．5 mg/m2，并且明确的推荐可以与化疗联合使用［29］。但是在许多方面比如最佳用法、应用时机、是否持续用药和疗程等仍未得到完全肯定。Mancuso等［30］实验发现，在进行肿瘤化疗之前，先使用恩度注射治疗，恩度能使杂乱的肿瘤血管排列有序化，这就有利于化疗药物顺利通过血管进入肿瘤组织内充分发挥作用，对杀死肿瘤细胞有很大促进作用，从而可以提高疗效。因而推测如果恩度停用7 d以上，肿瘤组织内新生血管可能已再生许多，对下次化疗药物进入肿瘤血管可能有影响。因此，在临床应用中注意:恩度应尽早在肿瘤早期使用，发挥恩度抑制血管快速生长的作用;在抗肿瘤药物应用之前使用恩度，以便更好地加强抗肿瘤药物的杀伤力;维持恩度稳定的药物浓度，前后两次使用药物的时间不应该相差较长，一般不超过7 d。

虽然既往对恩度的研究主要是对肿瘤血管生成的影响，但是实验和临床效果证明其对胃癌特别是晚期胃癌的治疗的确起到重要作用，其具体理论基础需要进一步研究。我们知道胃癌的转移多为淋巴结转移，现已知podoplanin与胃癌的淋巴转移有密切关系，故两方面是否有一定的关联，值得我们进一步深入探索。加强这两方面的研究可能为未来生产出更好的靶向药物带来极大的帮助，有望明显提高胃癌晚期患者的生存期。

3 结语

大量的实验结果表明，细胞间的黏附模式改变不是肿瘤细胞侵袭的唯一方式，其他的侵袭方式也在研究之中。在β胰岛素瘤和鳞状细胞癌动物模型上的研究显示，podoplanin能独立于EMT之外诱导集合细胞的侵袭和迁移。同时，podoplanin可以提高口腔鳞癌单细胞和MDCK细胞的侵袭能力，促进EMT介导的细胞迁移。很多课题关注癌症研究进展，越来越多的人开始研究单细胞和集合细胞侵袭分子机制，尝试研究这两种途径在胚胎发育期间的差别。近年来，肿瘤的血管生成及抑制理论进展很快，最重要的一部分就是关于内皮抑制素起到的作用越来越受到重视并得到证实，以此为理论基础的以抑制肿瘤新生血管为出发点的靶向治疗逐渐成为肿瘤治疗研究中又一个新的热点。podoplanin在胃癌中的表达情况，癌组织及癌旁的高LMVD是否增加癌的淋巴转移风险，以及重组人血管内皮抑制素与胃部podoplanin作用效果如何，都有待于我们进一步进行探讨，以便为恩度更好地应用于肿瘤的靶向治疗提供更多的证据支持。

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