桑椹及桑椹酒白藜芦醇的含量变化

朱祥瑞，章本学，杨逸文，蔡志伟，占鹏飞

（1.浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉县超龙蚕业发展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313060）

桑椹及桑椹酒白藜芦醇的含量变化

朱祥瑞1，章本学2，杨逸文2，蔡志伟2，占鹏飞3

（1.浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉县超龙蚕业发展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313060）

为探索人为控制提高桑椹与桑椹酒白藜芦醇含量，采用UV-C照射桑椹，于20±1℃避光放置后，进行发酵。试验结果显示：照射强度为0.6～3.6 KJ/m2的UV-C照射桑椹后避光放置，均可不同程度诱导白藜芦醇产生；添加果胶酶能提高桑椹酒白藜芦醇的含量，最高可以提高56%；桑椹酒发酵至96 h时，白藜芦醇含量达到最大值。

桑椹；桑椹酒；白藜芦醇；控制

桑椹（Fructusmori）因含有多种营养成分，如桑花青素、芸香苷、胡萝卜素、维生素，多种矿物质和微量元素等，逐渐被消费者认可和接受。还因桑椹含有白藜芦醇等功能性成分，而受到重视［1］。

随着对桑椹研究的深入及大众对桑椹产品保健功能的认知和接受，相关的桑椹产品，如桑果酒、桑果冻、桑椹膏、桑椹红色素等，生产规模不断扩大，其中桑椹酒是最具影响力和发展潜力的产品。

白藜芦醇（resveratrol）是桑椹酒产品的一个重要的功能性成分，也是桑椹酒市场竞争力的一个重要因素。为此，研究桑椹酒酿制前后，桑椹中白藜芦醇的含量变化以及人为调控的方法，对于保持和有限提高桑椹酒中白藜芦醇含量，有着重要意义。本文就桑椹采摘后和桑椹酒酿制中的白藜芦醇含量的变化，以及人为调节的方法进行了小结。

1 材料与方法

1.1 材料

桑椹：大10成熟果实，2013年5月中旬采摘于安吉县超龙蚕业发展有限公司马村桑园。

白藜芦醇标准样品：美国Sigma Chemical Co．LTD产品。

乙腈：美国霍尼韦尔公司（Honeywell）色谱级产品。

酵母：LAFFORT F33，法国LAFFORT公司产品。

果胶酶：法国LAFFORT果酒专用果胶酶。

1.2 仪器

LC-6A高效液相色谱仪、UV检测器：日本岛津公司。

色谱柱：Hypersil ODS柱（250 mm×416 mm，μm），美国Thermo Scientific公司。

分析天平：赛多利斯BSA124S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

发酵罐：RAT-5型5 L双层玻璃反应釜，予华仪器有限公司。

紫外灯管：UV-C紫外灯管（15W），飞利浦公司。紫外线检测仪：北京师范大学光电仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 桑椹紫外线处理

将装有UV-C（200～275 nm，中心波长254 nm）紫外灯管的照射架放置在操作台上。通过调节灯管到操作台面的距离，以确定紫外辐照的强度为2 w/m2［2］。照射辐照强度用紫外检测仪测定。

选取成熟适度的大10桑椹，放置与操作台上，摊薄，能使紫外光照射到每颗桑椹。分别照射0、5、10、15、20、25、30 min，UV-C的照射强度分别为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 KJ/m2。每隔2 min，翻动桑椹1次，使紫外线均匀照射到桑椹。紫外线照射后的桑椹于培养箱（20±1℃）中避光放置24 h［3～4］。

在培养箱中放置的桑椹，每隔4 h取样1次，样品速冻后冰箱保存。

1.3.2 桑椹酒酿制方法

（1）酵母准备：将LAFFORT F33酵母缓慢的加入到其10倍质量的37℃的热水中，搅拌溶解，活化，静置2 min，备用。

（2）原料准备：将紫外线照射25 min（3 KJ/m2）后的桑椹样品，解冻后，用破碎机破碎，投入发酵罐，添加LAFFORT果酒专用果胶酶，用量为0.2 g/L，并适量添加亚硫酸盐溶液，添加量为20 mg/L，充分搅拌。对照，不添加果胶酶。

（3）糖酸度调整：根据桑椹本身糖度以及桑椹酒酒度（10°）要求，添加一定量的食糖，调整桑椹汁糖度至250 g/L。按桑椹酒要求，调整酸度至6 g/L。

（4）发酵：活化后的酵母，按一定比例用量，加入到桑椹汁中充分搅拌，在20～24℃下发酵，当残糖小于5.0 g/L时，结束主发酵［5］。

发酵过程中，每隔24 h抽样，进行白藜芦醇分析。

1.3.3 白藜芦醇标准样品的制备

精密称取白藜芦醇标准样品2.5 mg，用无水乙醇溶解并定容于25 ml容量瓶中。

1.3.4 标准曲线的绘制

分别吸取白藜芦醇标准样品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m l，用无水乙醇定容于100 m l容量瓶中，摇匀，得浓度分别为1、2、3、4、5 mg/L白藜芦醇标准系列。以无水乙醇为空白对照，各进样10μl，在306 nm波长下进行HPLC分析。以样品白藜芦醇量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），计算曲线方程（n=5）和相关系数（R2）。

1.3.5 桑椹及桑椹酒试样的制备

（1）UV-C照射桑椹不同时间后的样品，解冻、高速匀浆，微孔过滤，收集滤，待检测。

（2）添加不同量酵母的桑椹汁，开始发酵后，每24 h取样1次，样品离心（6000 r/min，15 min）后，冰箱-40℃保存，待检测。对照样品（不添加果胶酶），处理相同。

1.3.6 桑椹和桑椹酒试样的HPLC测定

（1）色谱条件

流动相：乙腈∶水（35∶65）

检测波长：306 nm

柱温：室温

流速：1m l/min进样：10μl

（2）样品分析

在与测定白藜芦醇标准样品相同的条件下，测试桑椹和桑椹酒试样的白藜芦醇含量。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇标准曲线

白藜芦醇标准样品的HPLC图谱见图1。

以白藜芦醇标准样品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制标准样品的标准曲线见图2。

2.2 紫外线对桑椹白藜芦醇的诱导

桑椹经UV-C不同强度照射，经遮光保存一定时间后，桑椹内白藜芦醇含量变化见图3。

图3显示，未经紫外线照射的桑椹，从0～4 h，白藜芦醇含量稍有增加，随后便开始下降。经不同强度紫外线照射后，避光保存0～16 h，桑椹白藜芦醇含量均有一定程度的增加，16 h后开始下降；紫外线照射强度为3.6 KJ/m2，桑椹白藜芦醇产生的量最多，最高达16.3mg/L；遮光放置0～24 h，桑椹白藜芦醇均有增加，其中0～12 h，白藜芦醇含量的增加呈上升趋势，12 h后，含量呈下降。

以上情况说明，经紫外线照射后的桑椹，避光放置12 h后，白藜芦醇含量比初始值有一定的上升；紫外线照射强度，在0.6 KJ/m2～3.6 KJ/m2范围内，随着强度的增加，白藜芦醇含量都有所增加。与未经紫外线照射的桑椹比较，白藜芦醇含量均有一定的上升。

图1 白藜芦醇标样HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of resveratrolstandard sample

图2 白藜芦醇标准曲线Fig.2 Standard curve of resveratrol

图3 不同强度紫外线照射后桑椹白藜芦醇含量的变化Fig.3 Resveratrol content change ofmulberry fruitafter UVC dosagesirradiation

2.3 桑椹酒发酵条件的选择

桑椹汁添加一定量的酵母后，在20～24℃下进行主发酵。

酵母添用量与桑椹酒发酵液中糖含量的关系见图4。

图4 不同酵母用量与糖含量的关系Fig.4 The relation between the amountof yeastand the sugar content

从图4可知，酵母用量为250 mg/L的样品，发酵到第4 d时，糖含量剩下4.7 g/L，主发酵基本完成；其他的也接近5 g/L；发酵至第5 d，各组的含糖量均下降至5 g/L以下。其中，200 mg/L酵母用量的发酵效果，非常接近于250mg/L的效果。

酵母添用量与桑椹酒发酵液中酒精含量的关系见图5。

图5 不同酵母用量与乙醇含量的关系Fig.5 The relation between the amount of yeast and the ethanol content

从图5可知，发酵至第4 d，乙醇产生量开始变缓。酵母添加量为200 mg/L与250 mg/L的效果接近，乙醇含量分别达到9.9%和10.1%。结合对发酵酸的考察以及经济的考虑，认为200 mg/L酵母用量比较合适。

2.4 桑椹酒发酵条件对白藜芦醇含量的影响

未添加果胶酶发酵至第4 d的桑椹酒白藜芦醇的HPLC图谱，见图6。

图6 桑椹酒白藜芦醇HPLC图谱（发酵第4 d）Fig.6 HPLC chromatogram of resveratrol inmulberry wine（4th day of fermentation）

每24 h抽取发酵样品，测定白藜芦醇含量，结果见图7。

图7 果胶酶对桑椹酒白藜芦醇含量的影响Fig.7 Effect of pectinase on resveratrol content in mulberry wine

图7显示桑椹酒中的白藜芦醇含量随着发酵，有一定程度的提高；发酵到第4 d时，白藜芦醇含量到达最高；添加果胶酶有利于桑椹酒中白藜芦醇含量的提高，最高的达3.9 mg/L，比未添加果胶酶的2.5mg/L，增加了1.4mg/L，增幅达56%。

3 结果与讨论

3.1 桑椹采摘后经紫外线UV-C照射后，于避光放置一定时间后，能诱导产生白藜芦醇

紫外线照射是一种非生物胁迫因子。根据其波长，紫外光可分为UV-A（315～390 nm），可以全部通过臭氧层，达到地面；UV-B（280～315 nm）部分被臭氧层吸收，部分到达地面；而UV-C（200～275 nm），则几乎全部被臭氧层吸收。这意味着UC-A和UC-B对于桑椹等植物，已习以为常，没有诱导合成白藜芦醇的作用。而UV-C在自然条件下，因为剂量非常小，对桑椹合成白藜芦醇也不起作用，因此，通过人工提高UV-C的照射剂量，可以诱导桑椹合成白藜芦醇［2］。

3.2 紫外线照射强度以及避光放置时间对白藜芦醇的诱导有相关性

UV-C照射强度越强，诱导桑椹产生的白藜芦醇越多。

照射后，避光放置12 h内，白藜芦醇含量增加，随后下降。为此，利用紫外线照射诱导产生白藜芦醇，需在避光12 h内使用。鉴于实际条件，本实验采用3 KJ/m2UV-C照射后，避光放置了20 h后的桑椹为原料进行发酵，白藜芦醇含量没有达到理想水平。

3.3 使用果胶酶酿制桑椹酒，控制发酵时间，可以提高白藜芦醇含量

添加0.2 g/L酿酒专用果胶酶，可以提高桑椹酒白藜芦醇的含量；而且，发酵96 h后白藜芦醇含量达到最大值。为此，可以通过控制酵母量的添加，进而控制发酵完成的时间，以求桑椹酒白藜芦醇含量达到最大值。

3.4 桑椹酒发酵时，酵母添加量与主发酵完成有一定的关系

在实验范围内，控制酵母添加量为200 mg/L为比较合适的用量，可以使得主发酵基本完成，同时可以保证白藜芦醇含量处于一个比较高的位置。

［1］刘兆平，霍军生.白藜芦醇生物作用研究新进展［J］.国外医学（卫生学分册），2O02，（29）3：146～147.

［2］荣瑞芬，冯双庆，戴蕴青.短波紫外线照射对葡萄采后发病率及白藜芦醇化合物的影响［J］.保鲜与加工，2005，28（3）：8～9.

［3］Langcake P，Pryce R J.The production ofresveratrol an d the viniferins by grapevines in response to ultraviolet irradiation［J］.Phyto-chem istry，1977，16：1193～1196.

［4］李景明，马丽艳，刘艳娜.葡萄采后紫外线（UV）处理对白藜芦醇的诱导作用［J］，中外葡萄与葡萄酒，2004.4：16～19.

［5］马佩选.葡萄酒质量与检验［M］.北京：中国轻工业出版社，2002.

Content Changes of Resveratrol in Mulberry Fruit and Mulberry Wine

ZHU Xiang-rui1,ZHANG Ben-xue2,YANG Yi-wen2,CAIZhi-wei2,ZHAN Peng-fei3
（1.Institute ofapplied bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.AnjiChaolongSericultural Development Company,Anji 313300 Zhejiang,China; 3.Huzhou Academy ofAgricultural Science,Huzhou 3130600 Zhejiang,China）

To investigate the content change of resveratrol in fresh mulberry fruit and mulberry wine,the experimentwas carried out:UV-C irradiated mulberry fruit for severalminutes,and storage in dark place at 20±1℃,then ferment.The experiment result showed that the intensity of radiation tomulberry fruit from 0.6 to 3.6 KJ/m2and keep it in darkness, it could inducedresveratrol.The experiment also indicatedthat added pectinase,it could increased resveratrol content in mulberry wine,themaxwas raised 65%;when ferment for 96 h,the resveratrol content reached highest.

freshmulberry fruit;mulberrywine;resveratrol;control

S886.9

A

0258-4069［2013］03-032-04

湖州市科技局攻关计划农业项目（编号：2012C22154）

朱祥瑞（1957-），男，博士，副教授。主要从事蚕业资源开发利用的教学科研和推广。E-mail：xrzhu@zju.edu.cn