紫花苜蓿转基因研究进展

何 平，韦正乙，孙 卉，邢少辰

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118； 2.吉林省农业科学院农业生物技术研究所，吉林 长春 130033)

紫花苜蓿(Medicagosativa)，属于豆科苜蓿属，是一种高蛋白，营养丰富的多年生优质牧草。我国栽培紫花苜蓿已有2000多年历史，在各地均有分布，目前，紫花苜蓿在全球种植面积约为3×108hm2，而在我国种植面积约为2×107hm2[1]。作为世界上栽培时间最久、分布最广的豆科牧草之一，紫花苜蓿因蛋白质含量高(约占干物质量的20%)、含多种矿物元素、维生素和碳水化合物丰富[2]以及能进行生物固氮等优点，在农牧业生产中发挥着重要的作用，具有很高的经济和生态价值。紫花苜蓿的传统育种方法是常规杂交、回交，所需周期较长，并且高度依赖种质资源，制约了紫花苜蓿产业的可持续发展。Deak等[3]在1986年用农杆菌介导的方式将新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransforase,NPT)基因nptII导入苜蓿，首次实现了苜蓿的转基因操作，提高了转基因苜蓿对卡那霉素(Kanmycin,Kan)的抗性，证明了通过转基因技术改良紫花苜蓿的可行性。随后对于紫花苜蓿转基因的研究越来越多。本研究围绕抗非生物胁迫、抗生物胁迫、抗除草剂、品质改良和植物生物反应器5个主要方面将近年来关于紫花苜蓿转基因的研究进行归纳整理，以期为相关研究提供有益帮助。

1 抗非生物胁迫

非生物胁迫主要包括干旱、寒冷、盐碱、土壤中的离子和重金属等因素[4]，是制约农作物生产可持续发展的重要原因。植物对非生物胁迫的应答是一个复杂的网络调控机制[5]，因此，可以通过调节多个途径中相关生物活性物质的表达进行调控。作为世界上最主要的豆科牧草之一，品质和产量是紫花苜蓿生产中的重要指标，但其生长环境复杂，容易受到多种非生物胁迫的影响。因此，提高紫花苜蓿的抗逆水平，对于扩大种植面积、提升品质以及提高产量具有重要意义。

1.1抗盐碱 土地盐碱化是导致农作物减产的主要原因之一，也是制约农业、畜牧业发展的重要因素。目前世界上约20%的灌溉土地已经受到盐碱化的影响[6]，尤其在我国的华北、西北以及东北地区。紫花苜蓿的主要种植区域以盐碱地为主[7]，土壤盐碱化已经严重影响了紫花苜蓿的产量，因此提高其抗盐碱能力显得尤为重要。

很多逆境胁迫应答基因的启动子中都含有脱水应答元件(Dehydration Responsive Element,DRE)和与之类似的C-重复序列(C-repeat,CRT)，它们对基因的表达起调控作用。脱水应答元件结合因子(Dehydration Responsive Element Binding Factor,DREB)则能通过与DRE/CRT结合，进而对逆境胁迫相关基因的表达发挥调控作用[8]。Jin等[9]将大豆(Glycinemax)中DREB的同源基因GmDREB1用拟南芥(Arabidopsisthaliana)Rd29A启动子驱动，转入紫花苜蓿中进行表达，试验结果表明，在200 mmol·L-1NaCl处理条件下，转基因植株的叶绿素荧光值、游离脯氨酸含量和可溶性糖等生理指标明显高于非转基因的野生型植株，表现出强的抗盐性。刘艳芝等[10]已将DREB2A基因成功导入紫花苜蓿“公农1号”基因组中，T0代、T1代转基因植株都表现出了较强的抗逆能力，目前正在对获得的T2代转基因植株进行抗逆试验。

植物体内的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+Antiporter or Exchanger,NHX)是一种跨膜蛋白，它可以催化Na+和H+对液泡膜的横跨交换，排除植物体内多余的Na+，从而消除Na+的毒害作用，对维持细胞内的pH值和Na+浓度具有重要作用[11]。Li等[12]从耐盐植物苏打猪毛菜(Salsolasoda)中分离出NHX的编码基因SsNHX1，并将其转入紫花苜蓿中，随后对获得的转基因苜蓿2号、5号株系进行抗盐试验，NaCl的浓度选择为0、100、200、300和400 mmol·L-1。转基因株系表现出了很强的抗盐能力，尤其是在400 mmol·L-1NaCl条件下生存超过了50 d，这是迄今为止报道的植物抗盐性研究的最高水平。随后Zhang等[13]也从小麦(Triticumaestivum)中克隆出TaNHX2基因，并通过农杆菌介导转入紫花苜蓿中，结果表明，在高盐胁迫下T2代转基因植株中受盐诱导的酶活性高于野生型植株，当NaCl浓度从100 mmol·L-1增加到200 mmol·L-1时，转基因植株中液泡膜Na+/H+逆向活动率是野生型植株的2～3倍。Liu等[14]将具有表达碱蓬(Suaedacorniculata)NHX基因ScNHX1和液泡无机焦磷酸酶(H+-PPase)基因ScVP的转基因紫花苜蓿进行异花授粉，得到的ScVP/ScNHX1共表达植株在200 mmol·L-1NaCl和100 mmol·L-1NaHCO3处理下表现出了很强的抗盐碱性。

笔者所在实验室将来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的耐盐基因HAL1(Halotolerance gene 1)通过农杆菌介导叶盘转化法导入紫花苜蓿“龙牧803”。HAL1是较强的抗盐基因，其表达的蛋白质可以参与植物细胞对K+的吸收，维持细胞内K+/Na+平衡，从而消除Na+毒害。外源基因HAL1的表达，使得最终获得的转基因植株能够耐受住0.8%的NaCl胁迫，因此该基因显著提高了受体紫花苜蓿的抗盐能力[15]。

甜菜碱(Betaine)参与植物的渗透调节，可以在逆境胁迫下保护植物体内的某些酶类，是一种优良的渗透调节剂。甜菜碱醛脱氢酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase,BADH)是甜菜碱生物合成中的关键酶，可催化甜菜碱醛生成甜菜碱的反应过程。Yan等[6]将BADH基因转入紫花苜蓿中表达并获得了稳定遗传，转基因植株在0.9%的NaCl条件下生长良好，而非转基因对照组植株则慢慢变黄、枯萎，最终死亡。

植物叶绿体中进行的某些化学反应和电子传递过程会产生过氧化氢(H2O2)，若得不到及时清理就会通过Haber-Weiss反应转变成羟基自由基(·OH)，对植物具有毒害作用。抗坏血酸-谷胱甘肽(Ascorbate-Glutathione,AsA-GSH)循环是植物清除H2O2的主要途径，其中抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)是此途径中的关键酶[16]。Guan等[17]将水稻(Oryzasativa)中APX的编码基因OsAPx2克隆出来并在紫花苜蓿中进行表达，经过NaCl处理7 d后，转基因株系中H2O2含量明显低于野生型对照组，并且APX的酶活力是对照组的2.89倍，证明其抗盐水平明显提高。

外源化合物在植物体内进行生物转化时很容易转变成为高活性的中间产物，这些中间产物可以与植物体内的某些生物大分子组分发生共价结合，从而对植物造成危害。谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase,GST)可以竞争性地与这些产物结合，抑制其与其他生物大分子结合，起到解毒作用。Wang等[18]将野生大豆(G.soja)中的GST基因GsGST14转入到紫花苜蓿中超量表达，转基因植株中GST的酶活力是野生型植株的1.73～1.99倍，在100 mmol·L-1的NaHCO3处理下可以正常生长，表明其对碱的抗性得到了增强。

上述研究主要通过农杆菌介导方式将不同来源(大豆、拟南芥和苏打猪毛菜等)、不同种类(转录因子DREB和功能蛋白APX、GST等)的外源抗盐碱基因导入紫花苜蓿中表达，试验结果均表明，这些外源基因的表达可以提高转基因紫花苜蓿的抗盐碱能力。张立全等[19]则将盐生植物红树(Rhizophoraapiculata)总DNA利用花粉管通道法转入紫花苜蓿，并在随后的试验中证明转基因植株抗盐能力得到提高[20]，为紫花苜蓿转基因研究提供了新的方法。

1.2抗低温胁迫 低温是导致紫花苜蓿减产的另一个重要原因。在低温条件下，植物细胞会积累大量活性氧，从而对细胞内组分、细胞膜和某些蛋白质产生毒害作用，危害植物的正常生长，使植物减产，甚至死亡。一年种植，多年利用是紫花苜蓿的优势之一，所以增强其抗寒能力，提高其越冬率对于紫花苜蓿的增产和推广非常重要。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一种含金属酶类，可以通过催化超氧阴离子发生歧化反应，对植物体内的氧自由基进行清除，从而起到解毒作用。McKersie等[21]将拟南芥中Fe-SOD的cDNA置于花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic virus,CaMV)35S启动子下转入紫花苜蓿中超量表达，使该酶活性显著提升。该试验虽然没有降低低温对转基因紫花苜蓿叶片和须根的直接损伤，却使转基因植株的越冬率高出非转基因组25%，可能是由于Fe-SOD对寒冷导致的次级伤害有抵抗作用，从而间接地提高了紫花苜蓿的越冬存活率。

CO2可在植物体内ATP、多种酶和NADPH共同作用下转化为蔗糖。作为植物光合作用的主要产物，蔗糖对植物的生长发育具有重要作用。蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是蔗糖合成过程中的关键酶。Shearer等[22]将经过修饰的SPS基因置于CaMV35S启动子下转入紫花苜蓿中，田间试验证明，SPS基因的表达提高了转基因植株的抗寒性。

目前针对抗低温胁迫的紫花苜蓿转基因的研究报道较少，这可能是由于紫花苜蓿本身具有一定的耐寒能力，而提高紫花苜蓿的越冬能力对其推广利用至关重要。上述研究已证实，导入抗寒基因可以提高紫花苜蓿的抗低温能力，因此挖掘更多的抗寒基因资源将对今后利用转基因技术增强紫花苜蓿的抗寒能力提供帮助。

1.3抗干旱胁迫 干旱是农牧业生产中面临的最主要威胁之一，通过转基因技术导入抗旱基因是植物转基因研究的一个热点。紫花苜蓿作为重要的牧草，在我国西北地区约占栽培草地面积的80%[23]，因此提高其抗旱能力对提高其产量及维持生态环境意义重大。

Zhang等[24]从截型苜蓿(M.truncatula)中克隆出一种具有AP2结构域的编码基因WXP1并将其置于CaMV35S启动子下转入紫花苜蓿中，结果证明，作为结合转录因子，WXP1的导入使转基因植株叶片的蜡质含量提高了29.6%～37.7%，从而抑制了植株在干旱条件下叶绿素和水分的流失，使植株抗旱、抗寒性得到了加强。随后Jiang等[25]又将WXP1置于表皮特异性启动子CER6下转入紫花苜蓿中，经过3 d的水分胁迫和复水处理，转基因植株表现出较高的净光合效率、较高的相对含水量，并且能正常生长，植株的耐旱性得到了提高。

无机焦磷酸酶(H+-PPase)具有质子泵作用，在植物受到逆境胁迫时可以在一定程度上维持植物体内的离子平衡，降低离子毒害。Bao等[26]将拟南芥H+-PPase基因AVP1转入紫花苜蓿中进行超量表达，所得的转基因植株可以在缺水条件下生长良好，抗旱性得到了提高。

细胞分裂素(Cytokinin,CTK)是植物生长、发育过程中重要的激素类物质，可以减弱植物叶片对干旱胁迫的敏感性。已发现在自然条件下生存的一些根瘤菌可以生成CTK。Xu等[27]将工程根瘤菌接种到紫花苜蓿植株上，而载体中的异戊烯基合成酶(Isopentency Transferas,IPT)基因ipt用不同的启动子驱动，所获得的转基因植株通过了高强度的干旱胁迫处理，相对于非转基因对照组，大部分接种根瘤菌的转ipt基因紫花苜蓿生存下来，并检测到随着其叶子中玉米素浓度小幅上升，抗氧化酶的表达也增强，表明合成更多的CTK提高了紫花苜蓿对干旱胁迫的耐受性。

锌铁调控蛋白(ZRT,IRT-like Protein,ZIP)是植物体内重要的阳离子转运蛋白，通过调节植物体内Fe2+、Ca2+及Zn2+等离子含量防止植物中毒。李燕等[28]克隆出紫花苜蓿ZIP基因MsZIP并导回紫花苜蓿中超表达，经过25 μmol·L-1PEG-6000模拟干旱处理3 d，转基因植株表现出较强的抗旱能力。

以上研究表明，通过导入外源基因提高紫花苜蓿抗旱性是一种可行、有效的方法，为紫花苜蓿抗旱性育种提供了新途径。

1.4抗酸和铝离子毒害 目前，世界上40%的耕地和70%的非农业土地都具有较高酸性[29]，而在酸性土壤中，地壳中富含的铝元素转变为可溶性Al3+，直接作用于植物根部，抑制根部发育，影响其对水分和营养成分的吸收，并对植物产生毒害作用，导致植物减产甚至死亡。紫花苜蓿对土壤中的Al3+非常敏感，因此，运用转基因方式提高紫花苜蓿对Al3+的耐受性是很重要的。

苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase,MDH)可以催化草酰乙酸生成铝离子螯合剂苹果酸。Tesfaye等[30]用CaMV35S启动子启动苜蓿根瘤结节MDH基因neMDH在转基因紫花苜蓿中的表达，结果表明，与非转基因植株相比，转基因植株中柠檬酸盐、草酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐的含量提高了4.2倍。在20 μmol·L-1AlCl3处理下，非转基因植株已经不能正常生长，而转基因植株根系仍能正常生长，表明其对Al3+的抗性增强了。罗小英等[31]将neMDH转入紫花苜蓿中进行超量表达，使得转基因株系在耐铝离子胁迫试验中根系的相对伸长量比非转基因株系高出3.6%～22.5%，表现出对Al3+毒害更强的耐受性。

柠檬酸(Citric Acid)作为植物体内重要的有机酸，在受到Al3+胁迫时可以与Al3+形成螯合物，从而消除Al3+对植物的毒害。Rosellini等[32]将柠檬酸合成过程中的关键酶柠檬酸合成酶(Citrate Synthase,CS)基因CS置于拟南芥Act2启动子下转入紫花苜蓿中，通过铝胁迫处理，转基因苜蓿的体细胞胚根部能正常生长，经过苏木精染色表现为根尖处颜色变浅，这说明转基因苜蓿对铝的摄入量减少，提高了对铝的耐受性。Barone等[33]将铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中CS基因连接在拟南芥Act2和烟草根特异性启动子RB7这两个启动子下游并转入紫花苜蓿，所得的能表达CS基因的植株与野生型相比，具有对Al3+更强的抗性。

将生物螯合剂合成相关基因导入紫花苜蓿是目前通过转基因技术关于紫花苜蓿抗酸、抗铝离子毒害的主要研究方向，以上研究证明这是提高紫花苜蓿抗酸、抗铝离子毒害的有效途径。

2 抗生物胁迫

虫害和病害是生物胁迫的重要研究领域，这两个方面也是影响植物产量和品质的关键因素。由于畜牧业迅速发展，紫花苜蓿的市场需求不断增加，提高其抵御生物胁迫的能力，从而提高自身品质和产量就显得尤为重要。但是由于苜蓿本身具有较强的抗病、虫性状，且其生长环境恶劣导致病虫不易集中爆发等原因，使得在这方面的研究不像玉米(Zeamays)、大豆以及水稻等作物那样急迫。但是作为一种转基因的模式植物，同时又是重要的牧草作物，往往在其他作物中进行转化的抗性基因要先在苜蓿中进行功能验证试验，因此获得了许多抗生物胁迫的苜蓿转基因种质资源。

2.1抗虫性 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)在孢芽形成时会生成一种毒性蛋白，称为Bt毒蛋白。昆虫肠道中的酶能将其分解成小的毒性多肽，从而麻痹昆虫的消化系统，最后因肠道细胞壁损害导致昆虫死亡。Strizhov等[34]将人工合成的Bt基因导入紫花苜蓿中，试验结果显示，Bt基因的表达提高了转基因植株对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和海灰翅夜蛾(S.littoralis)的抗性。

蛋白酶抑制剂具有抵御植物虫害的能力。Samac和Smigocki[35]将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)I基因OC-I和II基因OC-II转入紫花苜蓿中，通过马铃薯(Solanumtuberosum)蛋白酶抑制剂II (Protease inhibitor II)启动子PinII控制这两个基因的表达，并通过载体上携带的GUS基因研究它们的表达方式。试验结果显示，通过GUS染色观测到在转基因紫花苜蓿叶和根部GUS基因得到表达。接种根腐线虫(Pratylenchusneglectus)导致GUS基因的局部表达，与非转基因对照组相比，转入OC-I和OC-II的转基因植株，根腐线虫的种群数量分别下降了29%和32%。

2.2抗病性 植物受到病原微生物感染时会产生植保素(Phytoalexin,PA)，对植物自身起到防御作用。Hipskind和Paiva[36]将花生(Arachishypogaea)中白藜芦醇合成酶(Resveratrol Synthase,RS)基因RS转入紫花苜蓿中，产生了反式白藜芦醇-3-o-β-D-吡喃葡糖苷(RGluc)。这一新化合物提高了转基因苜蓿对轮纹病(Phomamedicaginis)的抗性，并在一定程度上可以抑制病原孢子的形成。几丁质酶(Chitinase)广泛用于对真菌病的防治，对于真菌病毒具有抑制作用。Mizukami和Houmura[37]将来源于水稻中的几丁质酶基因RCC2转入紫花苜蓿中进行表达，结果显示，几丁质酶的形成使转基因紫花苜蓿对丝核菌(Rhizoctoniaspp.)产生了抗性。Yang等[38]将截型叶苜蓿中一个持家基因RCT1克隆出来并转化到紫花苜蓿中，大幅度增强了转基因植株对炭疽病(Colletotrichumspp.)的广谱抗性。

虽然针对苜蓿本身病虫害而选择基因进行遗传转化的案例不多，但现有的试验已为在苜蓿中开展遗传转化培育抗病、抗虫转基因新品种提供了丰富的经验和充足的理论依据。

3 抗除草剂

伴随着农业、畜牧业生产模式的转变，除草剂得到了大面积的推广和使用，但问题也随之而来，除草剂对农作物、牧草的生长同样具有抑制，甚至致死作用。紫花苜蓿苗期生长较慢，而除草剂残留期长，自然降解缓慢，为降低除草剂对紫花苜蓿生长的影响，通过转基因方式提高其对除草剂的抗性是一条有效途径。

作为广谱除草剂，Basta的主要活性成分是草丁膦，又称膦丝菌素，是一种有机膦类除草剂，其通过抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)的合成与生物活性，干扰氮代谢功能致使植物死亡。膦丝菌素乙酰转移酶(Phosphinthricin Acetyltransferase,PAT)对除草剂草丁膦具有解毒作用，刘艳芝等[39]将其编码基因Bar通过农杆菌介导的方式导入紫花苜蓿中，分子检测证明Bar基因导入紫花苜蓿基因组后，在5 mg·L-1Basta条件下，转基因苜蓿能够正常生长。

草甘膦也是一种广谱性除草剂，使用量很大，它能竞争性抑制植物体内芳香族氨基酸的生物合成过程中关键酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase,EPSPs)的活性。孟山都公司将Epsps基因导入紫花苜蓿中，田间试验表明，转Epsps基因紫花苜蓿对除草剂草甘膦的抗性显著增强[40]。

尽管除草剂基因本身的导入就能够给紫花苜蓿的规模化种植管理带来方便，但是在现代转基因发展中，其更多的是作为一种安全的筛选标记基因服务于将其他外源基因转入紫花苜蓿。伴随着新型除草剂的出现和紫花苜蓿抗性基因系统的开发，更多的抗除草剂转基因苜蓿品种将被陆续报道。

4 品质改良

含硫氨基酸、单宁和木质素这3种化合物的含量是决定紫花苜蓿品质的重要标准。通过转基因手段改变紫花苜蓿中这3种物质的含量，可以达到改良紫花苜蓿品质的目的。

紫花苜蓿中蛋白质含量约占其干物质量的20%[2]，但其中对牲畜质量和产毛量具有重要作用的含硫氨基酸含量却不多[41]，所以提高这些氨基酸的含量是改良紫花苜蓿品质的一个重点。Avraham等[42]将拟南芥蛋氨酸合成途径中调控第1个中间代谢物合成的关键酶胱硫醚Y合成酶(Cystathionine γ-Synthase,CGS)基因AtCGS的cDNA导入紫花苜蓿中，用拟南芥Rubisco小亚基启动子驱动表达。从试验所获得的30个转基因株系中选出4个表达水平最高的株系进行了进一步分析，发现这些株系中蛋氨酸、S-甲基蛋氨酸和甲硫氨酸的含量相对于野生型分别提高了32倍、19倍和2.2倍，游离的半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和与蛋白质结合的半胱氨酸含量分别提高了2.6倍、5.5倍和2.3倍。转基因紫花苜蓿中具有更高水平的蛋氨酸和半胱氨酸，改善了其品质。Bagga等[41]将含硫氨基酸含量较多的玉米蛋白Zein的编码基因构建于CaMV35S启动子下，通过农杆菌介导法转入紫花苜蓿中，使转基因紫花苜蓿的含硫氨基酸含量得到了提升。

由于紫花苜蓿中浓缩单宁(Condensed Tannins,CT)含量相对较少，单独喂食紫花苜蓿鲜草会使家畜患臌胀病。因此，增加紫花苜蓿中CT含量，提高家畜的消化率是改良紫花苜蓿品质的一个重要方向。Gruber等[43]将玉米花青素类化合物(包括CT)合成相关基因Lc转入紫花苜蓿中，获得的转基因植株经检测发现花青素的含量有所提高，其中CT含量也相应增加。

木质素(Lignin)含量与苜蓿细胞壁的硬度密切相关，但是过高的木质素含量会影响动物对紫花苜蓿的消化率。Jackson等[44]将反义基因转入紫花苜蓿中，降低木质素生物合成途径中肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase,CCR)和肉桂醇脱氢酶(Cinnamoyl Alcohol Dehydrogenas,CAD)的活性，使木质素的生物合成受阻，从而导致叶片中的木质素含量下降，提高了消化效率。Reddy等[45]通过转基因手段降低了4-香豆酸-3-羟化酶(4-p-Coumarate 3-Hydroxylase,C3H)的含量，同样降低了转基因紫花苜蓿中木质素的含量，提高了其在动物瘤胃中的消化率。Shadle等[46]则通过转基因手段将转基因紫花苜蓿中莽草酸羟基肉桂酰基转移酶(Shikimate Hydroxyeinnamoyhransferase,HCT)含量降低到野生型的15%～50%，木质素的含量也明显降低，消化率增加了20%。

紫花苜蓿作为一种重要的饲草其品质好坏至关重要。以上这些研究都表明，利用一些合成过程中的关键酶来改善紫花苜蓿的品质是目前主要的研究方向，利用转基因的方法可以有效改良紫花苜蓿的品质。无论是增强表达还是反义、干扰等沉默手段的介入，最终都是为紫花苜蓿通过代谢组学分析调节其代谢通路控制初生代谢、次生代谢产物积累达到改良的目的，相信随着研究的不断深入，将在转录因子和多基因导入协同调节代谢两方面取得更多成果。

5 植物生物反应器

利用天然或者人工改良过的植物细胞、组织和整株植株生产的具有重要生物功能的外源蛋白系统称为植物生物反应器。紫花苜蓿作为重要的牧草，本身不含有毒性物质[47]，是生产植物可饲疫苗的理想材料。近年来以紫花苜蓿作为生物反应器表达外源蛋白也是一个热点研究领域。

Legocki等[48]将猪瘟病毒(Classical Wwime Fever Virus,CSFV)的E2糖蛋白基因E2和肝片吸虫(Fasciolahepatica)的半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease)的编码催化结构域基因转入紫花苜蓿，用转基因植株叶片喂养小鼠后检测，发现小鼠体内产生了免疫应答反应。同样地，将口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)的多聚蛋白基因P1和3C导入紫花苜蓿中进行表达，检测食用表达产物后的小鼠的免疫性时发现，受到病毒危害时，小鼠肠道内发生了强烈的抗体反应[49]。Dong等[50]将密码子优化后的人A型轮状病毒(Rotavirus,RV)VP6蛋白的编码基因sVP6通过农杆菌介导的方式整合到紫花苜蓿基因组中，转基因苜蓿中VP6蛋白达到总可溶性蛋白的0.28%。每周用10 mg叶片提取物对雌性BALB/c小鼠进行灌胃，检测到小鼠具有高滴度的抗VP6血清IgG和粘膜IgA。用猴轮状病毒(Simian Rotavirus,SA)感染小鼠幼崽，表明该处理有效减弱了病毒感染所引起的腹泻症状。Lee等[51]将溶血性曼式杆菌(Mannheimiahaemolytica)A1型抗原GS60基因GS6054转入紫花苜蓿中，经过Western免疫印记分析，生产的抗原在干燥的转基因材料中可以稳定储藏超过一年，饲喂兔子时也能激起粘膜免疫应答，增强对巴氏德杆菌性肺炎(Pneumonicpasteurellosis)的免疫能力。上述试验结果表明转基因紫花苜蓿表达的产物能通过取食引起动物肠胃的粘膜免疫应答，是理想的生产植物可饲疫苗的生物反应器。

Huang等[52]将禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)结构蛋白S1中σC蛋白的编码基因分别置于CaMV35S启动子和水稻肌动蛋白启动子(Actin)下游并分别转入紫花苜蓿中进行表达，后期检测显示，在CaMV35S启动子和水稻Actin启动子调控下，转基因株系中σC蛋白的最好表达水平分别占总可溶蛋白的0.008%和0.007%。试验表明，无论在转化双子叶植物常用的CaMV35S启动子还是单子叶植物常用的Actin启动子启动下，外源基因都可以被有效表达且表达量差异不大。

此外，Bellucci等[53]将一个融合蛋白Zeolin的基因转入紫花苜蓿中进行表达，表达量为0.22～0.28 mg·g-1鲜叶。

上述这些证据均表明，紫花苜蓿适合表达外源蛋白，为今后用紫花苜蓿作为生物反应器生产药用蛋白打下了基础。

6 存在的问题和展望

经过20多年的研究与发展，紫花苜蓿转基因研究已经取得很多成就(表1)，通过农杆菌介导的方式转化紫花苜蓿的体系也已经基本成熟。许多抗性基因、药用蛋白基因等已经成功的在紫花苜蓿中得到表达，但是依然存在以下几个方面的问题。

6.1基因沉默现象 目前对紫花苜蓿转基因的研究都是通过核转化来对外源基因进行表达，DNA甲基化、位置效应等因素都可以引起基因沉默，导致外源基因表达量低或者得不到表达。目前所采用的应对策略包括修饰外源基因消除甲基化的影响、修饰核基质结合区(Matrix Attachment Region,MAR)降低基因沉默概率等，但是这些方法所取得的效果并不显著。因此，对基因沉默机制的研究还需要更加深入、系统，寻找更加有效的克服基因沉默的途径，提高外源基因的表达水平。另外，本课题组在2011年首次实现了紫花苜蓿叶绿体转化[52]，相比于核转化系统，叶绿体转化具有外源基因表达量高、没有基因沉默现象等优点[53]，为今后紫花苜蓿作为生物反应器开辟了一个新途径。

6.2研究进展不平衡 近些年紫花苜蓿转基因研究主要集中在抗非生物胁迫、植物反应器、品质改良这3个方面(表1)，而抗病虫、抗除草剂的研究很少。多是针对单一性状，导入单个基因，缺少多基因、大片段联合性状改良的研究，已有的报道大多处于实验室研究阶段，真正进入田间试验的研究很少，离商业化应用还有很长的距离。因此，平衡各方面研究并加快研究进程是本领域今后工作的重要任务。

表1 近年来紫花苜蓿转基因主要研究进展Table 1 Advances in alfalfa genetic transformation in recent years

6.3转基因紫花苜蓿的安全性问题 自转基因技术问世以来，就存在着关于转基因产物是否安全的争论，包括对人类、家畜和生态环境等的安全性。作为世界上广泛种植的重要牧草，转基因紫花苜蓿是否安全同样也引人关注。

在利用转基因手段改良紫花苜蓿性状的过程中，外源基因的表达可能会产生有毒物质，如抗虫转基因材料中会产生Bt毒蛋白，这种毒蛋白在家畜食用后能否被彻底降解？在农牧产品中有无残留？这些问题均是公众关注的焦点。截至目前，虽然研究并未发现外源基因的过表达对人类、家畜的健康产生威胁，但是进一步完善转基因紫花苜蓿安全评价体系，更深入地研究外源基因表达产物在食用后的降解过程，广泛深入地开展科普宣传，有利于消除人们的顾虑，将对转基因紫花苜蓿的商业化推广起到积极作用。

目前紫花苜蓿转基因研究中，筛选基因非常重要，通常采用抗性筛选基因从大量的非转化体中筛选出少量的转化事件。但是，筛选基因在筛选出转化事件后就没有继续存在的价值，况且其表达的蛋白可能会对转基因植株自身产生不良影响。许多文献在探索转化完成后如何消除筛选标记基因，目前常用的方法有共转化[54]、转座[55]、同源重组[56]和位点特异性重组[57]。但是紫花苜蓿转基因研究尚无此类报道，这应该成为今后研究的一个重点。此外，使用安全性选择标记也提供了另外一条途径，甘露糖-6-磷酸异构酶(Mannose-6-Phosphate Isomerase,PMI)、木糖异构酶(Xylose Isomerase,XI)等[58]是目前研究的主要安全性选择标记。

人类关注的另外一个问题是转基因紫花苜蓿是否会对生态环境造成不良影响，因为紫花苜蓿自交不结实，而常用的杂交、回交则加剧了基因漂移的几率。由于绝大多数植物遵循细胞质母性遗传规律，花粉飘移的问题可以通过叶绿体转化技术得到有效控制，但遗憾的是，紫花苜蓿属于少数的双性遗传物种，叶绿体基因同样可以通过花粉传播。目前主要通过分析其近缘植物种群，采取适当措施进行风险评估，降低有可能存在的环境风险，如实行生殖隔离或者物理隔离种植等形式加以预防。

此外，当前导入紫花苜蓿中的基因大多来源于微生物或草本植物，范围较窄且主要是单一性状，同时紫花苜蓿自身许多优良基因资源有待于深入挖掘利用，寻找更优良的基因资源将是今后紫花苜蓿遗传改良的研究重点。如植物中的核因子Y(Nuclear Factor-Y,NF-Y)家族基因是近几年研究转基因植株抗逆的一个热点基因家族，已被证实表达拟南芥[59]、玉米[61]中的NF-Y家族基因可以有效提高转基因植株的抗逆能力，但是在紫花苜蓿转基因研究中尚未见报道，可能成为今后的一个研究热点方向。本实验室已将紫花苜蓿中几个NF-Y家族基因克隆出来并转入到烟草和紫花苜蓿中，目前正在对获得的转基因植株进行检测。

紫花苜蓿转基因研究虽然已有20年之久，但与玉米、水稻、棉花(Gossypiumsp.)等主要农作物相比，紫花苜蓿的转基因研究起步较晚，研究深度和广度也相对不足。随着转基因技术研究的不断深入，将在紫花苜蓿重要农艺性状的遗传改良和生物反应器的研究与利用方面不断发展。

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