5个苜蓿品种叶片表面蜡质覆盖与抗旱性的关系

周玲艳，刘胜洪，秦华明，黎佩凤，杨凤婷，赵 钢

(1.仲恺农业工程学院生命科学学院，广东 广州 510225； 2.暨南大学理工学院，广东 广州 510623)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上最主要的栽培面积最广的优良豆科牧草之一，以“牧草之王”著称，在草田轮作、植被恢复和家畜养殖等方面发挥着重要作用[1]。但苜蓿生育期需水较多，每形成1 g干物质需水700～800 g，田间需水量达5 855 m3·hm-2。而我国苜蓿主栽区干旱缺水，严重制约着苜蓿的大面积推广，因此，对苜蓿的抗旱性研究显得尤为重要。在过去几十年里，对苜蓿的抗旱性研究取得了很多成果，研究内容从抗旱性的鉴定方面逐步转移到提高苜蓿自身抗旱性的研究上来。目前，苜蓿抗旱性育种方面的研究已经成为该领域的主要研究方向。

植物表皮蜡质是覆盖于植物表皮角质层上的一层可见的蜡状隆起，在通过调控植物表皮渗透性、限制非气孔性水分丧失以抵御水分胁迫方面发挥着重要作用[2-4]。张志飞等[5]发现高羊茅(Festucaelata)叶片表皮蜡质可通过对气孔导度的调节来减少气孔蒸腾，提高水分利用效率，最终提高其抗旱性。张正斌和山仑[4]研究表明，蜡质含量与蒸腾速率呈显著正相关。Vogg等[6]在对番茄(Lycopersiconesculentum)蜡质研究中发现，内表皮蜡质起着蒸腾屏障的作用。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[7-8]、水稻(Oryzasativa)[9]以及细茎冰草(Elymustrachycaulum)[10]中也均发现蜡质含量与植物抗干旱能力呈正相关。也有研究者认为，角质层蜡质组成[11-15]以及蜡质结构[16]是决定植物抗旱性的关键。Oliveira等[11]认为，植物表皮水分渗透性与蜡质成分的极性有关，低极性物质能更有效的防止水分散失。但有关蜡质晶体结构与叶水分散失过程之间的关系还有待进一步研究。

紫花苜蓿在逆境胁迫下可通过叶表皮蜡质含量、成分或结构的改变而提高抗逆性[10，17-19]，转基因苜蓿蜡质含量与抗干旱能力同样呈正相关[20-21]。而不同品种之间蜡质含量差异与抗旱性之间的关系尚未见报道。本研究以5个苜蓿品种为材料，分析苜蓿叶表面蜡质覆盖量以及抗性生理指标，旨在探讨不同苜蓿品种叶片蜡质覆盖量与抗旱性的关系，为选育抗旱苜蓿品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料 阿尔冈金、大富豪、WL525、苜蓿王和WL2321共5个苜蓿品种。材料种植地为广州市仲恺农业工程学院钟村实验场温室大棚。苜蓿种子经2% NaClO消毒后，在培养皿中发芽，挑取生长状态一致的健康小苗种植于温室大棚中，种植土壤质地为壤土，定期浇水。自然光照，温度为20～28 ℃，相对湿度为70%～90%。待苜蓿植株生长两个月后，取不同苜蓿品种叶进行各项指标的测定。

1.2试验方法

1.2.1不同苜蓿品种叶表面蜡质扫描电镜分析和含量测定 自植株上部采集第2片展开叶片，从叶中间沿叶脉切割，分正反两面，距中间叶脉 0.1 cm 处剪取样品进行扫描电镜观察，叶片表面蜡质扫描电镜分析的材料处理和制作参照周玲艳等[22]的方法，每个苜蓿品种分别取3枚叶片进行正反面表面蜡质扫描电镜观察。叶片蜡质提取参照周小云等[23]的方法，采用称重法计算叶面积，每个苜蓿品种重复测定3次，取其平均值。

1.2.2不同苜蓿品种叶片叶绿素浸提率的测定 取1.5 g苜蓿叶片并剪碎至约3 cm长，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗条件下轻轻摇晃，分别于20、40、50、60、90、120和210 min取3 mL浸提液用于测定其在λ664和λ647波长下的吸收值，每次测定后的浸提液倒回相应的瓶中，每个品种各做3个重复。

叶绿素浸提量(mmol·g-1)=7.93A664+19.53A647；

叶绿素浸提率=(不同浸体时间的叶绿素浸提量/210 min时的叶绿素浸提量)×100%。

式中，不同浸体时间分别为20、40、50、60、90、120 min。

1.2.3脯氨酸含量测定 脯氨酸含量采用酸性水合茚酸酮法[24]测定。

1.2.4PEG模拟干旱处理 取不同苜蓿品种枝条插于质量分数为20% 的PEG-6000溶液中，25 ℃恒温，光照强度为100～150 μmol·m-2·s-1，光照时间为14 h·d-1，观察不同苜蓿品种生长状态，并于处理36 h时进行拍照，重复3次。

1.3数据统计 试验数据采用SPSS 17.0及Excel 2003进行分析处理。显著水平为P<0.05(Dunman法)。

2 结果

2.1不同苜蓿品种叶片表面蜡质晶体的扫描电镜观察 为了考察不同苜蓿品种叶表面蜡质分布情况，本试验采用扫描电镜观察苜蓿叶片。结果表明，苜蓿王和阿尔冈金叶片蜡质片状结构大而密集；大富豪蜡质片状结构也大，但较稀疏；WL2321和WL525叶片蜡质片状结构小而稀疏(图1)。

2.2不同苜蓿品种叶蜡质含量测定 5个苜蓿品种中，苜蓿王的叶表面蜡质含量最高，为0.539 mg·cm-2，大富豪、阿尔冈金和WL2321叶表面蜡质含量相差不大，约为0.50 mg·cm-2，而WL525的叶表面蜡质含量最低，只有0.402 mg·cm-2。苜蓿王与WL525叶表面蜡质含量相差显著(P<0.05)(表1)。

2.3不同苜蓿品种叶片的叶绿素浸提率测定 随浸提时间的增加，各苜蓿品种的叶绿素浸提率增加(图2)。在浸提初期，苜蓿王叶绿素浸提速率较快，但到60 min以后，其叶绿素浸提速率相对其他品种明显减慢。在5个苜蓿品种中，WL525的叶绿素浸提率在不同时间段一直最大，且在90 min以内，大富豪与WL525叶片的叶绿素浸提速率差异显著(P<0.05)。

2.4不同苜蓿品种叶片的脯氨酸含量测定 脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，在植物抗旱性方面有着积极作用。不同苜蓿品种间的脯氨酸含量差异显著(P<0.05)，苜蓿王的脯氨酸含量最高，为231.2 μg·g-1，其次是大富豪，为108.7 μg·g-1，再次为阿尔金刚和WL2321分别为72.9和60.9 μg·g-1，而WL525的脯氨酸含量最低，只有35.7 μg·g-1(表1)。

2.5不同苜蓿品种的PEG模拟干旱处理 对不同苜蓿品种的蜡质覆盖量和生理特性的分析表明，不同苜蓿品种之间存在着差异，而表面蜡质在防止水分散失中起着非常重要的作用，可能与苜蓿植株的抗旱性有关。本研究取不同苜蓿品种枝条扦插于质量分数为20% 的PEG-6000溶液中进行模拟干旱处理，结果表明，苜蓿王萎蔫程度最低(图3)，说明苜蓿品种抗旱能力增强可能与植株叶片蜡质覆盖量增加有关。

3 讨论与结论

植物表皮蜡质层是植物自我防护的第一道屏障，对调控表皮渗透性、减少非气孔性水分丧失等起着重要作用[3-4]。Weng等[12]发现拟南芥lacs1lacs2双缺失突变体的叶绿素浸提率是野生型的4倍，失水率也比野生型高，对干旱更为敏感。Seo等[13]研究发现，拟南芥MYB96转录因子突变体叶表面蜡质含量与叶绿素浸提率和角质蒸腾呈正相关。Leide等[14]的研究表明，番茄ps突变体果实表面失水率比对照快5～8倍。Vogg等[6]在对番茄蜡质研究中发现，蜡质组成，特别是内表皮蜡质起着蒸腾屏障的作用。郭彦军等[19]在对苜蓿进行水分胁迫处理试验中发现，强抗旱植株叶面蜡质含量明显高于弱抗旱植株，说明叶表皮蜡质可能参与了控制水分散失的过程。本试验扫描电镜结果显示，苜蓿叶表皮存在致密蜡质层，蜡质晶体结构呈片状或梅花状。扫描电镜和蜡质含量测定结果表明，不同品种苜蓿叶表面蜡质含量不同，其中，苜蓿王的叶表面蜡质分布较密集，蜡质含量较高，而WL525叶表面蜡质分布较稀疏，蜡质含量较少。叶绿素浸提速率试验表明，苜蓿王叶片在浸提后期叶绿素浸提速率相对其他品种明显较慢，而WL525的叶绿素浸提率在不同时间段一直最大，说明不同苜蓿品种叶片表面蜡质覆盖与表皮渗透性呈正相关，可能参与调控水分的非气孔性丧失。

图1 不同苜蓿品种叶表面蜡质晶体结构扫描电镜观察Fig.1 Scanning electron microscopy analysis on structure of leaf epicuticular wax crystals of different alfalfa varieties

表1 不同苜蓿品种叶表面蜡质含量和脯氨酸含量测定Table 1 The total contents of leaf epicuticular wax and proline of different alfalfa varieties

张志飞等[5]认为，表皮蜡质含量可以作为高羊茅品种抗旱性鉴定的一个新指标。表皮蜡质含量对抗旱性的积极作用在其他多种植物的研究中已得到验证，如Bourdenx等[8]在过表达拟南芥蜡质合成相关基因CER1研究中发现，转CaMV35S::CER1拟南芥植株角质层通透性比野生型和突变体的低，对干旱胁迫有更强的耐受力。Islam等[9]通过对蜡质合成相关基因OsGL1-2的过表达发现，蜡质的积累可增强水稻对干旱的抗性。Zhang等[20]将豆科植物的一个转录因子WXP1基因转入苜蓿中，转基因植株叶单位面积的蜡质含量增加，抗旱性提高，而WXP1及WXP2转化拟南芥同样提高了其蜡质含量和抗水分胁迫的能力[21]。本研究通过质量分数为20% 的PEG-6000溶液进行模拟干旱胁迫，结果表明，蜡质含量最高的苜蓿王对干旱的敏感性最弱，说明苜蓿可能通过蜡质层的增厚而减少蒸腾来限制水分散失，增强植株抗旱能力。

图2 不同苜蓿品种的叶绿素浸提率分析Fig.2 The Chlorophyll leaching assays of mature leaves from different alfalfa varietiess

图3 不同苜蓿品种的PEG模拟干旱处理Fig.3 The simulated drought treatment of different alfalfa varieties

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸[26]。逆境条件下，植物体内脯氨酸含量显著增加，脯氨酸积累量与抗旱性呈正相关[19,26-27]。本研究对5个苜蓿品种叶片脯氨酸含量测定表明，苜蓿王叶片脯氨酸含量最高，而WL525叶片脯氨酸含量最低。说明苜蓿也可能通过渗透调节来限制水分散失。

本试验通过对苜蓿叶片表面蜡质覆盖观察和蜡质含量的测定以及抗旱生理和抗旱性分析，结果表明，苜蓿品种叶片表面蜡质覆盖与抗旱性存在一定的正相关性，可为抵抗各种生物和非生物胁迫的角质层蜡质基因在苜蓿品种的抗性改良和选育提供新途径和参考指标。

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